張平，譚延振，張冰，趙榮，金振曉，易定華，孫陽，易蔚，李香敏

1.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心血管外科，陜西 西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032；3.空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院腎臟內科，陜西 西安 710038

心肌纖維化是一種發(fā)生在損傷后和衰老過程中的病理狀態(tài)。目前，有效減少或逆轉纖維化的手段有限。找到抑制細胞外基質過度沉積的方法的關鍵是更好地了解負責膠原生成的心肌成纖維細胞[1]。心肌成纖維細胞、心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞是心臟的主要細胞成分[2-3]。由于成纖維細胞特殊的生物學表現(xiàn)[4]，迄今仍未建立成熟的細胞系，分離建立高質量的心肌成纖維細胞細胞系成為了抗心肌纖維化研究的關鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 10只SD仔鼠(1～3 d齡，雄性，體質量5～7 g)由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗條件嚴格按照國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》[5]進行。

1.1.2 實驗試劑 Anti-CD31 antibody、Anti-Vimentin antibody、Anti-alpha smooth muscle Actin antibody購于Abcam公司，DMEM低糖液體培養(yǎng)基購于HyClone公司，F(xiàn)etal bovine serum、FBS購于Gibco公司，Ⅱ型膠原酶購于Solarbio公司。

1.1.3 實驗儀器 Centrifuge 5424R(Eppendorf，5404F1221612)、彩盤面磁力攪拌器(德國IKA，S025)、Thermo Forma 3111 CO2培養(yǎng) 箱(Thermo Scientific，312748-11212)、超凈工作臺(美國，Thermo Scientific)、倒置熒光顯微鏡LX51S8F-3(Olympus Corporation，LK49655)、微量電子天平(德國賽多利斯，CPA225D)、FV10C-W3激光共聚焦顯微鏡(Olympus Corporation，1M35212)、臺式低速自動平衡離心機(Aence湘儀，L420)。

1.2 方法

1.2.1 實驗物品準備 眼科直剪、眼科彎剪、眼科彎鑷、大鑷子、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)、10 cm培養(yǎng)皿、吸管、酒精燈、無菌青霉素瓶、磁力攪拌器和攪拌子、口罩、帽子、無菌手套等；用1×PBS液為母液配置質量濃度為0.4%的胰酶溶液及0.1%的Ⅱ型膠原酶消化液，過濾除菌，室溫備用。

1.2.2 心臟組織取材 將SD仔鼠用75%乙醇消毒液Ⅰ浸泡15 s更換75%乙醇消毒液Ⅱ浸泡15 s消毒；左手固定SD仔鼠，彎剪斜行剪開左下胸部皮膚并向兩側分離，更換為直剪沿第4肋間剪開胸壁并向兩側撐開胸壁，左手配合擠壓胸腔將心臟擠出胸腔，沿心臟中部橫行將SD仔鼠心室部分剪下，置于冰浴的1×PBS中；更換剪刀，將SD仔鼠心臟組織周邊的纖維組織剪除并清洗血凝塊，放入另一個冰浴培養(yǎng)皿1×PBS中再次清洗；將修剪清洗好的SD仔鼠心臟組織移入無菌玻璃瓶中，換用另外一把眼科彎剪將心臟組織剪成1 mm×1 mm×1 mm組織碎塊。

1.2.3 消化 加入4～6 mL 0.4%的胰酶消化液混勻后室溫靜置消化3 min，吸棄上清液，加入約4 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶消化液，置入攪拌子，加蓋橡皮塞后置入37℃孵箱100 r/min攪拌消化10 min(圖1)，室溫靜置3 min，吸出上清液至10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液中，重復加入4 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶消化液攪拌消化5～6次直至剩余少許組織塊為止；800 r/min 5 min離心，棄上清。

圖1 磁力攪拌器攪拌混勻膠原酶消化液消化SD仔鼠心肌組織

1.2.4 差速貼壁分離細胞 加入約10 mL 10%FBS培養(yǎng)液重懸細胞，接種到一個75 cm2的培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁約90 min，吸出未貼壁細胞(主要為心肌細胞)作其他試驗用，1×PBS洗貼壁細胞(大部分為成纖維細胞)3次后，加入含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱中，約24 h后即可長滿。

1.2.5 純化心肌成纖維細胞 內皮細胞成簇生長，貼壁較成纖維細胞緊，不易從培養(yǎng)瓶底消化；心肌細胞生長條件要求高，傳代后不易存活，傳代提高成纖維細胞純度。

1.2.6 心肌成纖維細胞純度鑒定

1.2.6.1 光鏡觀察 倒置顯微鏡觀察成纖維細胞形態(tài)、均一性，進行拍照。

1.2.6.2 免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察 將P2心肌成纖維細胞接種激光共聚焦皿，進行Vimentin及CD-31染色，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照，Vimentin+/CD31-鑒定為心肌成纖維細胞。

1.2.7 心肌成纖維細胞激活實驗 應用TGF-β1誘導P2心肌成纖維細胞α-SMA(α-Smooth muscle actin，α-平滑肌肌動蛋白)表達變化，評估成纖維細胞活化能力，檢測評估分離的心肌成纖維細胞質量。

2 結果

2.1 心肌成纖維細胞貼壁時間 心肌成纖維細胞20 min已有貼壁，90 min貼壁完全。

2.2 細胞純度鑒定

2.2.1 光鏡觀察鑒定 如圖2所示：A圖可見未傳代心肌成纖維細胞伸展成梭形，胞核清晰且較大，呈橢圓形，分布較均勻，散在生長，不聚集成團，細胞排列緊密，24 h即鋪滿整個培養(yǎng)瓶底80%～90%；B圖可見第1次傳代心肌成纖維細胞呈突起的扁平的紡錘形或星形，均勻分布，有的交叉重疊生長呈融合狀態(tài)，并彼此連接成網(wǎng)狀。光鏡下觀察原代培養(yǎng)的心肌成纖維細胞可見混有少量成簇生長的多邊形內皮細胞及可搏動的心肌細胞，由于內皮細胞貼壁較成纖維細胞緊密及心肌細胞傳代不易成活，傳代后可提高心肌成纖維細胞純度。

圖2 光鏡下心肌成纖維細胞圖片(×100)

2.2.2 免疫熒光染色鑒定 圖3為第2次傳代心肌成纖維細胞免疫熒光染色鑒定圖片：其中A為心肌成纖維細胞Vimentin免疫熒光染色表達圖片，心肌成纖維細胞為Vimentin陽性表達；B為肌成纖維細胞CD-31免疫熒光染色圖片，心肌成纖維細胞為CD-31陰性表達。經過鑒定P2代成纖維細胞純度可達95%以上。

圖3 P2代心肌成纖維細胞免疫熒光染色鑒定圖片

2.3 心肌成纖維細胞α-SMA表達檢測 圖4為P2代心肌成纖維細胞α-SMA表達免疫熒光染色圖片：A表示分離所得的P2心肌成纖維細胞已開始少量表達α-SMA，但未被組裝成動力肌絲形式；B表示，應用TGF-β1誘導心肌成纖維細胞后α-SMA大量表達，且被組裝成動力肌絲形式，心肌成纖維細胞轉化成激活狀態(tài)的肌成纖維細胞。

圖4 心肌成纖維細胞α-SMA表達

3 討論

心肌成纖維細胞、心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞是心臟的主要細胞成分[2-3]，其中心肌成纖維細胞是心肌纖維化主要參與細胞類型[6]，原代心肌成纖維細胞的分離純化建立高質量的細胞系是心臟病理生理學研究中至關重要的基礎。

雖然大多實驗室都是應用酶消化聯(lián)合差速貼壁分離方法將心肌成纖維細胞分離，但具體的細節(jié)不盡相同，具體在于酶的種類、使用方法、差速貼壁時間不同[7-8]。本實驗采用胰酶破壁消化+Ⅱ型膠原酶消化，在消化過程中應用磁力攪拌器攪拌使Ⅱ型膠原酶與組織塊混勻促進消化，避免了在消化過程中吸管吹打產生的機械剪切力對細胞的損傷，從而減低心肌成纖維細激活胞轉化為肌成纖維細胞，由于不同細胞貼壁時間不同，成纖維細胞較早貼壁，將消化好的細胞混液接種至75 cm2培養(yǎng)瓶后，貼壁90 min，輕搖培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁細胞懸液(心肌細胞)，1×PBS洗貼壁細胞3次，去除部分非成纖維細胞成分，提高成纖維細胞純度。在傳代時，胰酶消化后震蕩培養(yǎng)瓶，吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶底，吸出細胞懸液，遺留部分貼壁更緊的內皮細胞，通過傳代再次提高成纖維細胞純度。通過光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)的均一性及應用免疫熒光染色檢測第2次傳代成纖維細胞Vimentin+/CD-31-表達，成纖維細胞達純度可達95%以上。

在細胞模型上研究纖維化，細胞的基礎狀態(tài)至關重要，在成纖維細胞的分離過程中很多因素都可引起細胞的激活，表達α-SMA，轉化為肌成纖維細胞，如果在細胞分離過程中不能有效控制這些因素，在下一步的實驗中處理組與對照組之間細胞的生物學特征的差異將縮小，甚至無法得出統(tǒng)計學差異。首先取心臟的操作要迅速，減少熱缺血時間；其次控制好心臟剪碎程度，組織塊過大不易消化，組織塊過小造成受損傷細胞數(shù)量增加，1 mm×1 mm×1 mm左右大小較合適；本實驗中首先應用胰酶消化心肌組織塊外結締組織，使細胞暴露，再應用Ⅱ型膠原酶消化細胞間的連接使細胞分散，避免了胰酶消化力強對細胞造成損傷，同時也縮短了Ⅱ型膠原酶的消化時間，減輕了細胞長時間暴露于Ⅱ型膠原酶造成的損傷。在細胞分離過程中，機械力對細胞造成的損傷至關重要，本實驗在消化過程中應用磁力攪拌器代替滴管吹打，有效地減小了組織塊混合液高速通過滴管口的剪切力造成的細胞損傷。應用免疫熒光染色檢測第2次傳代后成纖維細胞α-SMA表達情況，分離的P2成纖維細胞α-SMA表達水平很低，且對TGF-β1誘導刺激反應良好，刺激后大量表達α-SMA，證明本方法分離的成纖維細胞損傷小，功能好。

綜上，應用胰酶初步消化，磁力攪拌器代替滴管吹打混勻Ⅱ型膠原酶消化液與心肌組織塊，促進膠原酶消化順利進行該的方法可成功分離并建立高質量的心肌成纖維細胞系。