周青青，劉 瀟，賈 蕊，黨靜霞

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061）

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種病因不詳、發(fā)病后進展迅速而又缺乏有效治療手段的嚴重致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是運動神經(jīng)元疾病中最常見和最嚴重的類型[1]。目前本病缺乏有效的治療措施，F(xiàn)DA批準的利魯唑和依達拉奉僅能延長患者數(shù)月的生存期，并不能有效阻止疾病進展。遺傳學(xué)、生物標志物等的研究進展為本病的早期診斷、預(yù)后評估提供了依據(jù)。本文重點介紹ALS的生物標志物研究進展。

1 基因組生物標志物：識別ALS的遺傳基礎(chǔ)

每一個基因變化本身都代表著一種新的基因生物標志物，可以用于臨床診斷。目前，全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）和全外顯子測序（WES）是用于鑒定/篩選與ALS相關(guān)的新致病性變體的兩個主要方式。其中致病基因可直接導(dǎo)致疾病發(fā)生或進展，而疾病修飾基因的突變將影響ALS疾病的發(fā)生或進展。這些基因的發(fā)現(xiàn)為深入探討疾病的發(fā)病機制及精準診斷和治療提供了基礎(chǔ)。

1.1 致病基因自1993年第一個ALS致病基因SOD1的發(fā)現(xiàn)開始[2]，目前已有20~30個相關(guān)基因明確與ALS的發(fā)病機制相關(guān)。這些基因代表當前診斷過程中最常見的基因突變，包括FUS、SQSTM1和TARDBP基 因[3]。2011年 發(fā) 現(xiàn) 的C9ORF72是 高 加索人群中ALS患者最常見的基因突變，以及后續(xù)發(fā)現(xiàn)的一些少見的基因類型，包括VCP、VAPB、SORT1、UBQLN2和FIG4等。主要涉及的生物學(xué)功能包括蛋白質(zhì)質(zhì)量控制與穩(wěn)態(tài)、RNA穩(wěn)定性、DNA損傷與修復(fù)、自噬的調(diào)制失衡、神經(jīng)元軸突細胞骨架動力學(xué)改變等[4]。近年來識別的ALS多個相關(guān)新基因為ALS的發(fā)病機制等研究提供了新的方向和證據(jù)。TBK1突變與ALS的異常細胞清除有關(guān)，在TBK1相關(guān)的ALS患者及脊髓病理中均發(fā)現(xiàn)TDP-43陽性包涵體，TBK1-ALS可看作是另一種“TDP-43蛋白病”[5]。CHCHD10突變進一步提示ALS患者線粒體功能障礙[6]。KIF5A在ALS中的發(fā)現(xiàn)強調(diào)了細胞骨架缺陷在ALS發(fā)病機制中的重要性[7]。編碼微管相關(guān)蛋白的TUBA4A基因在ALS中的發(fā)現(xiàn)，進一步提示細胞骨架結(jié)構(gòu)動力學(xué)在ALS發(fā)病機制中的作用[8]。CCNF突變發(fā)現(xiàn)于歐洲的一個ALS家族中，編碼細胞周期蛋白F，提示異常蛋白泛素化和可能的異常細胞周期再進入是ALS中神經(jīng)元丟失的機制[9]。由于這些基因突變發(fā)現(xiàn)較晚，且并非常見的突變，其具體作用機制及臨床表現(xiàn)還需進一步確認。

ALS的臨床表型與基因突變類型具有相關(guān)性，如SOD1A4V和C9ORF72突變的患者生存期短、進展快，SOD1H46R和SOD1D90A突變的患者生存期長，F(xiàn)USP525L突變患者的發(fā)病年齡通常較早、進展快，C9ORF72突變患者多合并認知功能損害等。C9ORF72六核苷酸基因擴張與ALS及額顳葉癡呆(FTD)均有關(guān)系[10]。因此，遺傳生物學(xué)標志物有助于患者的分層和精確用藥。

1.2 疾病修飾基因遺傳分析也可以通過分析疾病修飾基因來幫助預(yù)測疾病的進展。GWAS研究提供了影響ALS表型的基因數(shù)據(jù)，其中EPHA4和CX3CR1的研究最為廣泛[11]。EPHA4功能缺失性變異可顯著延長ALS患者的生存期。與生理性CX3CR1V249V等位基因相比，I/I及V/I等位基因攜帶者的生存期約縮短25個月[12]。此外，CAMTA1的SNP rs2412208和rs139550538等位基因使ALS患者的生存期延長了4~8個 月[13]。KCNJ11的rs5219位 點 可 使 延 髓 型ALS患者的生存期延長。KCNJ11的基因產(chǎn)物是ATP敏感性鉀通道的一個組成部分，因此它不僅可用于診斷，而且未來可用于進行治療策略的開發(fā)[14]。藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，某些SNPs影響了患者對藥物的療效，如攜帶UNC13A基因rs12608932風(fēng)險等位基因的ALS患者服用碳酸鋰后，隨訪12個月的患者死亡率明顯低于不攜帶風(fēng)險等位基因組患者[15]。因此，制定針對特定人種ALS的致病基因篩查策略對于疾病的精準診斷、疾病進展及預(yù)后的評估、藥物使用的指導(dǎo)具有重要意義。

2 蛋白質(zhì)生物標志物

蛋白質(zhì)是常規(guī)臨床分析最理想的生物標志物。由于其通常在血液等生物流體中穩(wěn)定分泌，且可用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）等免疫分析法或基于質(zhì)譜的方法進行檢測，因此基于蛋白質(zhì)的生物標志物已被用于ALS的診斷和分層研究。由于組織活檢難以用于神經(jīng)退行性疾病的診斷，因此包括血液和腦脊液（CSF）在內(nèi)的生物流體是最受關(guān)注的用于識別ALS的候選生物標志物[16]。

2.1 神經(jīng)絲蛋白（NFs）NFs是目前研究最為廣泛的ALS蛋白質(zhì)生物標志物。NFs是由4個亞單位組成的中間絲，包括神經(jīng)絲重鏈（NFH）、中鏈（NFM）、輕鏈（NFL）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的α-交聯(lián)蛋白（α-nternexin）。后者在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中被外周蛋白取代。它們經(jīng)過了多種翻譯后修飾，其中最重要的是磷酸化修飾[17]。其中研究最多的是磷酸化的NFH（pNFH）和NFL。大量證據(jù)支持神經(jīng)絲水平作為ALS診斷要素。有研究表明，與對照組相比，ALS患者CSF中NFL和pNFH升高，診斷敏感性和特異性＞80%，它們也與疾病進展率和生存率相關(guān)。血清和CSF的NFL之 間 有 很 高的相關(guān)性[18]。CSF的NFL與疾病亞型相關(guān)，當上運動神經(jīng)元負荷增加或疾病進展速度更快時，基線水平更高，而與患者年齡無關(guān)。此外，與健康對照組相比，ALS患者的血NFL水平明顯升高，高初始NFL水平是生存率的一個強有力的獨立預(yù)測因子，而隨著疾病的進展，NFL的水平變化不明顯，因此NFL似乎可作為診斷和預(yù)后的標志物，而不是疾病進展的標志物[19]。多項研究已經(jīng)闡述了NFL和pNFH蛋白在CSF和血液中作為ALS潛在生物標志物的作用[20]。NFL和pNFH是軸突損傷的標志物，可直接反映出神經(jīng)元的健康狀況[21]。而NFL對ALS的特異性較低，因為額顳葉癡呆（FTD）、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病(CIDP)和吉蘭-巴雷綜合征（GBS）患者中均可見NFL的升高。因此，CSF中的pNFH是一種更好的生物標志物，可更好鑒別ALS與其類似疾病。

2.2 聚-二肽C9ORF72基因中的六核苷酸GGGGCC重復(fù)擴增是ALS中最常見的致病性突變。通常，C9ORF72基因在第一個內(nèi)含子中包含大約30個GGGGCC重復(fù)，但是在ALS攜帶者中，這些重復(fù)可達成百上千次。從變異體C9ORF72基因轉(zhuǎn)錄的RNA被一種稱為重復(fù)相關(guān)非ATG翻譯（RAN）機制翻譯，產(chǎn)生5種不同的多肽：GA聚集體、GR聚集體、GP聚 集 體、PR聚 集 體和PA聚 集 體，在5種 聚 二 肽中，含有精氨酸的GR聚集體和PR聚集體比其他類型毒性更大[22]。據(jù)報道，GR聚集體或PR聚集體在體內(nèi)和體外均能誘導(dǎo)細胞毒性。GR聚集體或PR聚集體在人星形膠質(zhì)細胞中通過損害pre-mRNA的剪接或核糖體RNA成熟或通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞死亡。GA聚集體可通過抑制蛋白酶體誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[23]。這些多肽在細胞中積累并在C9ORF72突變攜帶者的CSF中已有發(fā)現(xiàn)[24]。由于體細胞不穩(wěn)定，通常用于遺傳分析的血細胞很可能不會發(fā)生這種異常的多肽聚集體，而神經(jīng)細胞則會出現(xiàn)。因此，將基因檢測與多肽類檢測結(jié)合起來，有望對臨床診斷有更多的幫助。

2.3 TDP-43TDP-43是一種核蛋白，一般情況下不會在細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。生理條件下，TDP-43主要在細胞核內(nèi)，可在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭，少量TDP-43可轉(zhuǎn)運到線粒體。當TDP-43突變發(fā)生時，或在一定的細胞應(yīng)激下，可轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，進而被過度磷酸化和聚集，在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞中形成泛素陽性聚集物，引起神經(jīng)系統(tǒng)病變，其具體機制尚不明確[25]。在超過97%的ALS病例中發(fā)現(xiàn)由TDP-43組成的聚集體，其他大多是由攜帶SOD1或FUS致病性突變導(dǎo)致的SOD1或FUS蛋白聚集引起的ALS類型。因此，TDP-43聚集物或TDP-43異常形態(tài)的存在可作為一種通用的ALS生物標志物[26]。最近有研究發(fā)現(xiàn)了可針對不同的TDP-43變異體的單鏈抗體，該研究也表明存在疾病特異性TDP-43變異體。也就是說，與ALS患者相比，存在C9ORF72基因突變的個體血漿中具有不同的TDP-43形式。因此，這些抗體不僅有助于ALS的診斷，而且有助于將患者分為不同亞型[27]。CSF中TDP-43的測定可用于ALS與帕金森病（PD）、多發(fā)性硬化癥（MS）和GBS的鑒別診斷[28]。

2.4 其他蛋白質(zhì)胱抑素C（CysC）是一種內(nèi)源性半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可通過刺激自噬和抑制組織蛋白酶B的神經(jīng)毒性以保護運動神經(jīng)元免受損傷，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細胞外蛋白穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[29]。ALS患 者 的CSF減 少，CSF中CysC蛋 白 水 平與ALS患者的生存率呈正相關(guān)，因此有可能作為預(yù)后的一種生物標志物[30]。有研究鑒定了CysC對SOD1突變介導(dǎo)的ALS毒性的神經(jīng)保護作用，外源性添加的CysC可保護神經(jīng)元，包括原代培養(yǎng)的運動神經(jīng)元[29]。CysC是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護劑，針對運動神經(jīng)元的CysC可能為ALS提供一種新的治療策略[31]。

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）是一種高度保守的同四聚體蛋白，主要在脈絡(luò)叢和肝臟細胞中合成，并分別分泌到CSF或血漿中[32]。TTR也在神經(jīng)元中產(chǎn)生，可參與神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)修復(fù)和軸突生長。數(shù)項研究表明TTR在ALS中持續(xù) 下降，ALS脊髓中TTR水平的降低可能是由于運動神經(jīng)元數(shù)量和剩余運動神經(jīng)元中TTR表達水平降低所致[33]。與健康對照組相比，尸檢發(fā)現(xiàn)ALS患者的CSF中TTR水平降低，表明ALS的CSF中TTR譜峰的降低在疾病過程的早期發(fā)生，并持續(xù)發(fā)生于整個疾病過程中?？梢约僭O(shè)ALS運動神經(jīng)元的低TTR水平可降低其神經(jīng)保護功能，從而更容易受到神經(jīng)變性損傷。這一假設(shè)值得進一步探討[34]。

C3是血清中含量最高的補體成分，主要由巨噬細胞和肝臟合成，在C3轉(zhuǎn)化酶的作用下，裂解成C3a和C3b兩個片段，后受血清中I因子、H因子和蛋白酶的作用，又可逐級水解為C3b、C3f、C3c和C3dg，在補體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中均發(fā)揮重要作用。ALS患者血清和CSF中補體組分C3和C4的活化片段增加。ALS患者脊髓和運動皮質(zhì)的膠質(zhì)細胞也有這些片段的升高。據(jù)此推測，ALS患者CSF中C3c的高水平不僅是由于通過血腦屏障的滲漏，而且是由于C3組分與特異性腦損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴細胞上的受體結(jié)合減少所致[35]。

C反應(yīng)蛋白（CRP）是一種由促炎細胞因子調(diào)節(jié)的急性期蛋白，在炎癥反應(yīng)過程中由肝細胞分泌。CRP是炎癥反應(yīng)的生物標志物，對多種腫瘤有重要的預(yù)后預(yù)測價值。目前的研究顯示，ALS患者血清CRP水平較高者比CRP水平較低者進展更迅速。此外，血清CRP水平與ALSSRs-R評分呈顯著負相關(guān)，表明血清CRP水平是ALS患者有用、可行和預(yù)后的重要因素[36]。

此外，與健康對照組相比，ALS患者血清白蛋白降低。ALS患者血清白蛋白水平降低可能是由炎癥狀態(tài)引起的[37]。ALS患者血漿中鐵蛋白的增加，提示在ALS患者的血漿和血清中存在氧化應(yīng)激的鐵調(diào)節(jié)異常[38]。

一項深入研究表明，在以上的蛋白質(zhì)標志物中，C9ORF72和TDP-43中 由GGGGCC擴增 而來的神經(jīng)絲、聚-二肽是診斷ALS最有前景的蛋白質(zhì)生物標志物[16]。

3 代謝物

對循環(huán)代謝物分析的多數(shù)研究顯示，ALS患者血清和血漿中的特定代謝物普遍有上調(diào)的趨勢，這與ALS患者的高代謝相一致，但不同研究間存在較大差異。例如，與細胞能量代謝相關(guān)的肌酸在CSF和血漿中持續(xù)升高[39]。在ALS患者中也發(fā)現(xiàn)，CSF和血漿中丙酮酸和葡萄糖含量增加，這可能反映了在一些ALS患者中觀察到的糖酵解代謝失調(diào)。糖酵解上調(diào)與較短的生存時間相關(guān)，因此可以作為一種預(yù)后生物標志物[40]。同樣，在CSF和血漿中觀察到的膽固醇和LDL的上調(diào)也反映了ALS患者脂質(zhì)代謝的整體失調(diào)[41]。其他如同型半胱氨酸等神經(jīng)毒性代謝物在所有體液中持續(xù)增加[42]。另有研究證實了鞘脂下調(diào)和糖基神經(jīng)酰胺上調(diào)，表明ALS患者能量代謝的全面失調(diào)[43]。此外，肌酐和棕櫚酰鞘磷脂與線粒體功能有關(guān)，這些生物標志物在ALS血漿中升高，與ALSFRS-R評分呈負相關(guān)[44]。在橫斷面研究中，ALS患者血清尿酸水平較健康對照組降低[45]。尿酸作為一種強大的抗氧化劑，有助于對抗ALS中的氧化應(yīng)激[46]。血清尿酸、肌酐、白蛋白和總蛋白水平的降低發(fā)生在疾病早期，表明這些基于代謝物的生物標志物的早期變化可能與疾病的病理生理進展有關(guān)，而不是ALS患者營養(yǎng)不良的結(jié)果[47]。

4 未來ALS診斷的其他生物標志物

除了上述生物標志物可能有助于臨床診斷ALS外，還有一些其他措施可用于ALS診斷，但均處于研究初期。

4.1 皮膚活檢外胚層皮膚和神經(jīng)組織有共同的胚胎起源，這可能是許多神經(jīng)退行性疾病伴隨皮膚變化的原因[48]。更重要的是，皮膚的變化先于神經(jīng)癥狀的出現(xiàn)。19世紀CHARCOT首次報道了ALS患者的皮膚變化，包括膠原纖維直徑和密度以及膠原和彈性蛋白交聯(lián)的變化[48]。已發(fā)現(xiàn)在ALS患者皮膚中有幾種蛋白表達錯誤，但皮膚結(jié)構(gòu)的變化尚不能完全與ALS聯(lián)系在一起，因此目前不具有診斷潛力。然而，多數(shù)ALS患者中可發(fā)現(xiàn)TDP-43沉積物。TDP-43具有核定位信號，主要存在于核內(nèi)。在ALS患者死亡后的腦組織中觀察到TDP-43胞質(zhì)沉積[49]。而由于獲取用于分析的大腦或脊髓標本的操作具有侵入性，其在診斷中的應(yīng)用有限。因此，皮膚活檢的應(yīng)用值得進一步研究。表皮細胞表達TDP-43增加的原因目前尚不清楚，但可能是由于神經(jīng)細胞和表皮細胞之間的TDP-43異常增殖，其機制類似朊病毒。

4.2 尿液標志物有研究顯示，與健康個體或PD及MS患者相比，ALS患者尿液中的神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75ECD濃度顯著升高，而快速進展的ALS患者的尿液中p75ECD濃度更高[50]。在一個中國隊列研究中也證實了這一觀點。該研究對101名ALS患者、108名PD和MS等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者和97名健康對照者進行了尿液分析，結(jié)果顯示，ALS組的p75ECD較其他組升高，較高的p75ECD水平也與臨床分期的增加相關(guān)[51]。此外，與對照野生型小鼠相比，SOD1-G93A小鼠尿液中的p75ECD濃度更高；而且在癥狀出現(xiàn)之前已經(jīng)出現(xiàn)增高。尿液p75ECD可作為預(yù)測ALS疾病進展及評估疾病嚴重程度的標記。

4.3 非編碼RNA越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA（ncRNA）（小于100個核苷酸RNA）可作為潛在的 生 物 標 志 物，包 括tRNA、rRNA、piwi-RNA和miRNA。在充分了解其生物發(fā)生和功能的基礎(chǔ)上，miRNA已成為大多數(shù)研究的主要焦點。已有研究表明，miRNAs在ALS患者和健康對照者的CSF、血清等體液中表達存在差異[52]。而最近的研究顯示，使用RT-qPCR測定的2個小RNA表達的比值，與使用單個小RNA相比，提高了鑒定ALS病例的敏感性和特異 性，如miR206/miR338-3P、miR9/miR129-3P和miR335-5P/miR338-3P這3對小RNA組合能夠更清楚地區(qū)分ALS患者和對照組患者，其敏感性為84%，特異性為82%[53]。這提示用1個以上的小RNA作為ALS的“生物標志物”是可取的。

也有可作為ALS中的生物標志物的其他類型分子的研究，例如長非編碼RNA（lncRNA），可順式作用于沉默或增強近端基因的表達，并且已知其在正常神經(jīng)元發(fā)育以及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進展中具有關(guān)鍵作用。在體液中也檢測到lncRNA，且已被認為是肺癌、三陰性乳腺癌和心血管疾病的潛在診斷和/或預(yù)后生物標志物。因此，lncRNA可作為包括ALS的神經(jīng)退行性疾病的候選新生物標志物[54]。

鑒于ALS患者生存和殘疾的異質(zhì)性較大，早期準確診斷ALS很可能需要一組生物標志物，而不是單一的某一個生物標志物，以更有效地診斷ALS。大多數(shù)診斷性生物標志物的相關(guān)研究將患者與健康對照組進行對比。此外，通過替代生物標志物以評估疾病如何隨時間變化的縱向研究，將能夠為ALS的亞型及其預(yù)后提供更多的信息。未來的生物標志物研究應(yīng)包含所有表型數(shù)據(jù)以及遺傳和生物信息，以幫助分層。

5 結(jié) 論

ALS相關(guān)標志物的研究是為了給ALS患者提供更好的診斷和治療措施，盡早診斷可盡早啟動神經(jīng)保護治療以延緩疾病進展。另外，能夠監(jiān)測疾病進展的標志物也有利于判斷疾病的嚴重程度，同時在ALS藥物實驗研究中評估治療效果，對于ALS治療新藥物的研發(fā)有重大意義。此外，單一標志物的作用有限，未來需要聯(lián)合應(yīng)用生化和遺傳學(xué)等方面的證據(jù)，從而為ALS患者的診斷和治療提供更有價值的依據(jù)。