于少帥 朱輝 余鳳玉 宋薇薇

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/海南省院士團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新中心 海南文昌 571339)

植原體是一類寄生于植物韌皮部、通過刺吸式口器昆蟲傳播的原核病原菌［1-3］。由植原體引起的植物病害尚無有效的治療藥劑，是植物的毀滅性病害，因此該類病害以防為主［1-3］。由植原體引起的椰子致死性黃化病是椰子產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性病害，該病害傳播快、致病性高、危害十分嚴(yán)重［4］。椰子致死性黃化病地理分布較為廣泛，在美洲、非洲和東南亞等地區(qū)均有分布［4］。已有研究表明：引起椰子致死性黃化病的植原體種類較為豐富，包括16SrI（-B）、16SrIV（-A、-B、-C、-E、-F）、16SrXI（-A、-B）、16SrXIV、16SrXXII（-A、-B）、16SrXXXII（-B）等多個組或亞組［4-6］。

椰子是中國海南主要的特色作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)、綠化和生態(tài)價值［7］。截止目前，椰子致死性植原體在國內(nèi)尚未見報(bào)道，但海南是中國椰子主產(chǎn)區(qū)，椰子致死性植原體在中國的適應(yīng)性分析和入侵中國的風(fēng)險分析表明，中國為椰子植原體的適生區(qū)，華南沿海及海南大部分地區(qū)為中、高風(fēng)險區(qū)［8-9］。結(jié)合前期研究基礎(chǔ)和相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)、制定了由植原體引起的椰子致死性黃化病的綜合防控技術(shù)規(guī)程，以椰子致死性植原體檢測鑒定為基礎(chǔ)，以防為主，在此基礎(chǔ)上對椰子致死性黃化病進(jìn)行綜合防控，以期有效防控此類病害。

1 適用范圍

本技術(shù)規(guī)程規(guī)定了椰子致死性黃化病防控過程中的術(shù)語和定義、分子檢測技術(shù)、防控技術(shù)和注意事項(xiàng)等要求。

2 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程。

2.1 植原體（Phytoplasma）

植原體是一類寄生于植物韌皮部、無細(xì)胞壁、尚不能人工分離培養(yǎng)的一類重要的原核致病菌［1-3］。

2.2 椰子致死性黃化病（coconut lethal yellowing diseases）

由植原體引起的椰子致死性病害，典型癥狀表現(xiàn)為成熟或未發(fā)育完全的果實(shí)脫落，葉片從葉尖開始向莖干的方向變黃，老葉先表現(xiàn)癥狀，最后是嫩葉表現(xiàn)癥狀，葉片最后從莖干上脫落［4］。目前中國尚未見該病報(bào)道，但分析表明中國為該病病原的適生區(qū)，極具被入侵風(fēng)險［8-9］。

2.3 PCR擴(kuò)增

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction， PCR） 是一種在生物體外放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)［10］。

2.4 巢式PCR

使用2 對PCR 引物對特定DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增。第一對PCR 引物擴(kuò)增片段和普通PCR 相似，第二對PCR 引物結(jié)合在第一對PCR 引物擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部，第二次PCR 擴(kuò)增片段短于第一次PCR 擴(kuò)增片段，擴(kuò)增結(jié)果更特異［10］。

2.5 綜合防控

根據(jù)檢測分析結(jié)果，采用物理清除、化學(xué)噴殺、水肥調(diào)節(jié)等綜合技術(shù)措施對病害進(jìn)行預(yù)防與控制。

3 巢式PCR檢測

3.1 總DNA提取

樣品葉片取樣量為0.1 g，利用CTAB 法提取疑似發(fā)病椰子葉片的總DNA［11］，樣品總DNA 提取方法參考天根植物基因組DNA 提取試劑盒說明書。

3.2 PCR擴(kuò)增

引起椰子致死性黃化病的病原植原體采用植原 體 通 用 引 物 R16mF2/R16mR1［12］和 R16F2n/R16R2［13］進(jìn)行擴(kuò)增檢測。將引物 R16mF2/R16mR1 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后用作巢式PCR模板，直接PCR 擴(kuò)增引物R16mF2/R16mR1 擴(kuò)增的植原體目的條帶長約1 400 bp，巢式PCR 擴(kuò)增引物R16F2n/R16R2擴(kuò)增的植原體目的條帶長約1 200 bp，PCR 擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.3 PCR反應(yīng)體系

PCR 反 應(yīng)體系為 25 μL，包括 12.5 μL 2 ×PCR Master Mix （包含0.05 U/μLTaqDNA 聚合酶，4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs），上游引物和下游引物 （10 μmol/L） 各1.0 μL，1.0 μL DNA 模板，用ddH2O補(bǔ)至25μL。

3.4 PCR反應(yīng)條件

反 應(yīng) 條 件 ： 94.0℃ 5 min； 94.0℃ 30 s，53.0℃ 40 s，72.0℃ 90 s （第一輪 PCR） 或 80 s（第二輪PCR），共35個循環(huán)；72.0℃10 min。

3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用SYBR Green I 染色，經(jīng)1.0 %（w/V）瓊脂糖凝膠、凝膠成像系統(tǒng)檢測，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序分析。

3.6 序列編輯與鑒定

將獲得的核苷酸序列采用DNA MAN 6.0 軟件（Lynnon Corporation， Vaudreuil-Dorion，Quebec，Canada）進(jìn)行編輯及多重比對分析。在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 分析 （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），明確所得核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的椰子致死性黃化植原體相關(guān)核苷酸序列的同源性是否較高。利用MEGA 7.0 軟件的鄰接法（neighbor-joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［14］。將自展值（bootstrap value）設(shè)為1 000，用以評估軟件生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹的穩(wěn)定性和支持率［15］，明確所得核苷酸序列與已報(bào)道的椰子致死性黃化植原體相關(guān)核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系是否較近。根據(jù)序列同源性的高低與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的遠(yuǎn)近，判斷并鑒定椰子致死性黃化植原體及其種類等信息。

4 防控技術(shù)

4.1 把好種苗檢測關(guān)

目前中國尚未見椰子感染致死性植原體的報(bào)道，椰子種苗的出入境檢測十分重要。植原體最易通過苗木等材料傳播，因此，應(yīng)對外來的椰子苗木進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，以防止椰子致死性植原體的入侵。

4.2 產(chǎn)地檢疫

在椰子產(chǎn)地，應(yīng)通過植原體通用型引物PCR擴(kuò)增，加強(qiáng)對產(chǎn)地椰子果及其種苗的檢驗(yàn)檢疫，保證從椰子產(chǎn)地輸出的果實(shí)、種苗等產(chǎn)品健康無毒，從源頭上切斷椰子致死性植原體的傳播。

4.3 選育抗耐病資源

植原體病害目前尚無有效治療藥劑，因此，抗耐病種質(zhì)資源的選育、應(yīng)用是防控此類病害的根本措施。為防控椰子致死性黃化病，應(yīng)通過對現(xiàn)有資源進(jìn)行抗逆性評價鑒定、品種雜交、分子育種等選育椰子抗耐植原體資源，并在全球椰子種植區(qū)進(jìn)行種植推廣。

4.4 清除病源

加強(qiáng)田間管理，及時清理、燒毀椰子林中表現(xiàn)致死性黃化病癥狀的椰子樹和苦楝、長春花、辣椒、細(xì)圓藤、山黃麻、蛇婆子等相關(guān)植原體寄主植物［16-20］，清除椰子林中的植原體傳染源。

4.5 切斷傳播途徑

根據(jù)不同地區(qū)不同椰子林中刺吸式口器昆蟲的種類及其種群動態(tài)變化，確定噴灑殺蟲劑的時間及周期，全面清除椰子園中的葉蟬類、粉虱類、蝽類等刺吸式口器昆蟲［3］，預(yù)防植原體在椰子林中的傳播。

4.6 水肥調(diào)節(jié)

在椰子種植過程中，在貧瘠的椰子種植區(qū)施用氮肥，在酸性土壤有效磷極低的情況下增施磷肥，在椰子果實(shí)發(fā)育初期增施鉀肥，根據(jù)椰子種植園地情況適當(dāng)澆水，以防止干旱對椰子生長的影響［7］。通過加強(qiáng)水肥管理，增強(qiáng)樹體免疫力。

5 注意事項(xiàng)

5.1 擴(kuò)大葉片取樣范圍

棕櫚作物染病組織中植原體含量低，且分布不均。因此，在DNA提取時，應(yīng)取盡量多的葉片粉碎混勻后，再稱取0.1 g樣品進(jìn)行DNA提取。此外，植原體寄生于植物韌皮部，椰子等棕櫚作物纖維組織發(fā)達(dá)，因此，在DNA提取時，應(yīng)適當(dāng)增加椰子樣品的粉碎時間以便使樣品充分粉碎、病原充分釋放。

5.2 防止巢式PCR污染

巢式PCR 需要進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，在第一輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，需要對第一輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，以用作第二輪PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)模板。在第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋過程中，要將擴(kuò)增產(chǎn)物放4℃冰箱靜置1 h 以上，在超凈工作臺上進(jìn)行稀釋，以防止產(chǎn)生污染，否則將影響第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效果。

5.3 設(shè)置實(shí)驗(yàn)對照與重復(fù)

為保證PCR 擴(kuò)增結(jié)果與測序結(jié)果的準(zhǔn)確客觀，在進(jìn)行椰子致死性黃化病或疑似病害樣品植原體檢測過程中，應(yīng)設(shè)置陽性對照和陰性對照。前期已檢測到植原體的樣品可作為陽性對照，去離子水和健康無植原體的樣品可作為陰性對照，相關(guān)的陽性對照和陰性對照各設(shè)置1 個；并通過重復(fù)1～2次實(shí)驗(yàn)對PCR擴(kuò)增結(jié)果與測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。