◆作者：周鵬 唐勝球 潘宇杰 董小英

◆單位：韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院

霉菌是真菌的一部分，在自然環(huán)境中分布廣泛，且種類繁多，最常見的霉菌有曲霉、青霉、鐮刀菌、麥角菌屬等。其中，霉菌中產(chǎn)生毒素最甚者為黃曲霉，黃曲霉能夠分泌黃曲霉毒素（AFT）B1、B2、G1、G2 等18 種，而黃曲霉中產(chǎn)毒素B1 是已經(jīng)被判定為毒性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，其毒性比氰化鉀大10 倍，比砒霜大68倍。1993 年，世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定黃曲霉毒素為已知毒性極強(qiáng)的致癌化學(xué)物質(zhì)之一（李書國(guó)等，2009）。另有數(shù)據(jù)顯示，全世界平均每年因霉變而損失的糧食大約是其總產(chǎn)量的10%（劉國(guó)信，1999）。因此，預(yù)防霉菌帶來的危害，針對(duì)抑制霉菌生長(zhǎng)的研究是十分必要的。

植物精油是由植物的葉、枝、根莖等原材料，經(jīng)過蒸餾等方法萃取出的具有芳香性氣味的物質(zhì)。植物精油作為一種天然的活性物質(zhì)，具有很強(qiáng)的殺菌抑菌、抗氧化以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生物學(xué)功能（鄔本成等，2013）。國(guó)內(nèi)外研究表明，天然植物精油對(duì)常見的真菌如黃曲霉菌具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，且部分精油對(duì)一些黃曲霉毒素有一定程度的降解作用（王萍等，2021）?，F(xiàn)有資料顯示，丁香、小茴香、大蒜、香菜、山蒼子和八角等植物都具有較強(qiáng)的抑菌作用，且具有諸多的藥理作用。如丁香和小茴香可抑制致病性真菌及葡萄球菌、痢疾和大腸桿菌等。山蒼子含有檸檬醛等活性成分，易與黃曲霉毒素等有害物質(zhì)發(fā)生分解、氧化等化學(xué)反應(yīng)，是消除黃曲霉毒素最有效、最安全的物質(zhì)（曲春陽(yáng)，2012；管志遠(yuǎn)等，2005；李春美等，2004）。佟晶晶等（2018）證實(shí)，多種精油復(fù)合的效果比單一精油對(duì)特定細(xì)菌的抑制效果更強(qiáng)。此外，研究表明，天然植物精油作為防霉劑對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)無毒害作用（Pereira 等，2014）。由此可見，植物作為飼料防霉劑具有一定研究意義，而復(fù)合植物配方精油更有可能具有好的防霉效果。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)部分天然植物精油的防霉作用進(jìn)行研究，利用聯(lián)合抑菌效果評(píng)價(jià)方法，在所選植物精油篩選出對(duì)霉菌具有最佳抑菌效果的單方或復(fù)方精油的最佳配方。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物：山蒼子、丁香、小茴香、大蒜、香菜和八角。

霉菌：在實(shí)驗(yàn)室從發(fā)霉玉米粉中提取并分離培養(yǎng)。

飼料：玉米粉。

土豆培養(yǎng)基：取新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。先將馬鈴薯洗凈，去皮后切成0.5 cm3的小塊煮沸15~20 min，然后用四層紗布過濾（佟晶晶等，2018），加入葡萄糖、瓊脂和蒸餾水至1000 mL，高溫滅菌20 min，留存?zhèn)溆谩?/p>

察氏培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)室自配（硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 玉米粉中霉菌的分離培養(yǎng)

取適量玉米粉于培養(yǎng)皿中，放入溫度為40℃，濕度90%的培養(yǎng)箱中讓其霉變。待玉米粉霉變后，用接種環(huán)刮取適量霉菌放入培養(yǎng)皿中，置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)兩天。

2.2.2 霉菌懸液的制備

用接種環(huán)挑取3-4 環(huán)（每個(gè)菌落扣一下）于10 mL 無菌管的無菌水中，采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法測(cè)出總菌數(shù)（血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），然后制成106~107CFU/mL均勻霉菌懸液。

2.2.3 霉菌抑制試驗(yàn)

參照濾紙片法（王加啟等，2003）。無菌條件下，將霉菌菌懸液0.1 mL 滴入察氏培養(yǎng)基，涂布均勻即含菌平板。將1 片直徑6mm的無菌濾紙片貼于含菌平板的皿內(nèi)中央，并使之展開。向?yàn)V紙片滴加精油，精油添加體積相等（20μL）。以添加無菌水的濾紙片為空白對(duì)照，培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。細(xì)菌于37℃條件下恒溫培養(yǎng)20 h，霉菌于28℃條件下恒溫培養(yǎng)4-5 d。培養(yǎng)結(jié)束，用十字交叉法測(cè)量各抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。每組重復(fù)3 次。

參照抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>18 mm 為高度敏感，10mm~18mm 為中度敏感，5mm~10 mm 為低度敏感。

2.2.4 最低抑菌濃度試驗(yàn)

參照最低抑菌濃度MIC 試驗(yàn)（胡俊，2001），將菌懸液0.1 mL滴入培養(yǎng)基中，涂布均勻即含菌平板。精油用0.22μm 的微孔過濾器過濾，并用tween-80 稀釋。吸取各稀釋液1 mL 于無菌條件下加入含菌平板的皿蓋中央，倒置培養(yǎng)，使培養(yǎng)皿內(nèi)空氣中的精油濃度分別達(dá)到1~180 mg/L 空氣系列濃度（使細(xì)菌培養(yǎng)皿內(nèi)空氣中精油濃度分別達(dá)到0.18000、0.09000、0.04500、0.02250、0.01125 mg/mL），以不生長(zhǎng)菌的樣品的最低濃度為精油對(duì)該菌的氣相MIC，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同植物來源精油對(duì)飼料霉菌的抑制效果

通過查閱大量的參考文獻(xiàn)與資料，選出了對(duì)霉菌有較好抑制作用的6 種植物，并對(duì)其蒸餾出山蒼子精油、丁香精油、小茴香精油、大蒜精油、香菜精油和八角精油。通過抑制圈直徑測(cè)定方法，篩選出具有較強(qiáng)抑制飼料霉菌活力的精油，抑制霉菌結(jié)果見表1。由表1 可知，精油對(duì)飼料霉菌的抑制效果為：山蒼子> 丁香> 小茴香> 大蒜> 香菜。丁香、山蒼子和小茴香精油屬于高度敏感的范疇，山蒼子精油在該實(shí)驗(yàn)中能有效抑制霉菌生長(zhǎng)，屬三種精油中最敏感的；丁香與小茴香精油對(duì)霉菌有較強(qiáng)的抑制作用，它們的抑制圈十分明顯，抑制圈呈橢圓形，輪廓線表現(xiàn)不規(guī)則狀。其它精油雖然也對(duì)飼料霉菌有一定的抑制作用，但是相比之下不太明顯。

表1 6 種植物精油對(duì)飼料霉菌的抑制效果

3.2 復(fù)方精油對(duì)飼料霉菌的抑制作用

由3.1 測(cè)定結(jié)果可知，山蒼子精油是最具有抑制霉菌的單方精油，其次是小茴香精油和丁香精油，為了更深入地了解它們聯(lián)合效果，將山蒼子精油和其它兩種精油等體積復(fù)合，分別測(cè)定它們對(duì)霉菌的抑菌圈直徑，其結(jié)果如表2。結(jié)果顯示，山蒼子、山蒼子+ 小茴香（1∶1）和山蒼子+丁香+ 小茴香（1∶1∶1）組的抑菌圈均大于90 mm。因此，山蒼子單方精油及山蒼子+ 小茴香和山蒼子+ 丁香+ 小茴香的復(fù)合精油均有較好的抑制飼料霉菌效果。

表2 復(fù)方植物精油對(duì)飼料霉菌的抑制效果

為了科學(xué)評(píng)價(jià)山蒼子精油、小茴香精油和丁香精油單方精油及其復(fù)合精油對(duì)霉菌的抑制效果，分別進(jìn)行了最低抑菌濃度（MIC） 的測(cè)定和聯(lián)合抑菌評(píng)價(jià)（FIC）實(shí)驗(yàn)。由表2 可知，小茴香+ 山蒼子精油（1∶1 混合）的MIC 比復(fù)合小茴香+ 山蒼子和丁香精油（1∶1∶1 混合）低，說明復(fù)合小茴香+ 山蒼子精油的抑菌效果比復(fù)合小茴香+ 山蒼子+ 丁香精油的抑菌效果好。此外，復(fù)合小茴香+ 山蒼子精油的FIC 為0.926<1，說明復(fù)合精油中的小茴香精油和山蒼子精油的抑菌效果是相加作用。而復(fù)合小茴香+ 山蒼子+ 丁香中的1

3.3 不同比例復(fù)合小茴香和山蒼子精油對(duì)飼料霉菌的抑制作用

由以上試驗(yàn)結(jié)果可知，在多種復(fù)合精油中，小茴香精油和山蒼子精油復(fù)合的抑菌效果最佳。但不同的精油配比對(duì)抑菌效果則不同，因此，為了更進(jìn)一步確定最佳復(fù)合精油配比，對(duì)小茴香精油和山蒼子精油以（7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7）比例混合，每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，用無菌水作為對(duì)照，進(jìn)行了10天抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3 可知，各種不同配比濃度的復(fù)合小茴香+ 山蒼子精油對(duì)飼料霉菌均有抑制作用，且以1∶1、1∶3、1∶5、1∶7（小茴香精油：山蒼子精油）混合精油的抑菌能力相對(duì)較好，而1∶5（小茴香精油：山蒼子精油）的MIC 值最低。因此，最好的復(fù)合精油混合比例是小茴香精油：山蒼子精油=1∶5。

表3 復(fù)合小茴香和山蒼子對(duì)飼料霉菌的抑制作用

4 討論

飼料在加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中容易發(fā)生霉變，霉變后產(chǎn)生的霉菌毒素不僅污染飼料、降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還會(huì)引起畜禽產(chǎn)生一系列的健康問題，如中毒、腹瀉、生長(zhǎng)和繁殖障礙等癥狀，嚴(yán)重影響動(dòng)物的生產(chǎn)（Rocha 等，2014）。王曉佳的調(diào)查研究證實(shí)，75%～100%的飼料樣本含有一種以上的霉菌毒素，在低劑量的情況下就可能影響動(dòng)物健康。大多數(shù)霉菌能夠同時(shí)產(chǎn)生多種霉菌毒素，飼料可能同時(shí)被幾種霉菌毒素污染，進(jìn)而引起畜牧產(chǎn)品質(zhì)量下降和飼料工業(yè)的混亂，甚至可能導(dǎo)致高污染作物的拒收和處理（王曉佳，2021）。由于植物精油具有無毒、較強(qiáng)的抑菌性和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，本文主要對(duì)山蒼子、丁香、小茴香、大蒜、香菜和八角植物精油的抑菌特性進(jìn)行了研究，并證實(shí)其對(duì)飼料霉菌具有一定的抑制效果。

抑菌圈的大小反映了精油對(duì)霉菌的抑制效果，抑菌圈直徑越大，精油抑制霉菌效果越好。最低抑制濃度是能抑制培養(yǎng)基內(nèi)霉菌生長(zhǎng)的最低精油濃度，是測(cè)量抗菌藥物的抗菌活性大小的一個(gè)指標(biāo)；而聯(lián)合抑菌評(píng)價(jià)是通過評(píng)價(jià)復(fù)合精油的各種成分相互作用的效果。植物精油在抑制霉菌生長(zhǎng)及毒素產(chǎn)生方面效果理想，是潛在飼料防霉劑（梁丹丹等，2015；尚繼峰等，2007；王利 敏 等，2018； 代 安 娜 等，2021）。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所質(zhì)量與安全研究室比較了山蒼子油、丁香酚、肉桂醛、檸檬醛、桉葉油、茴香油、樟腦油和薄荷油等8 種植物精油對(duì)黃曲霉、鐮刀菌、赭曲霉等生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的抑制效果，發(fā)現(xiàn)肉桂醛和丁香酚可有效抑制黃曲霉的生長(zhǎng)及產(chǎn)毒。另有研究證實(shí)，黃曲霉、灰綠曲霉及青霉對(duì)丁香精油屬于高度敏感（梁丹丹等，2015）。此外復(fù)合植物精油防霉劑（肉桂醛∶檸檬醛∶丁香酚∶薄荷醇=3∶3∶2∶2，v/v/v/v）應(yīng)用在玉米儲(chǔ)藏上，可有效抑制黃曲霉生長(zhǎng)（尚繼峰等，2007）。采用濾紙片法測(cè)定丁香、八角、薄荷、花椒、大蒜、橙皮及復(fù)合精油對(duì)從玉米中分離得到的黃曲霉、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、青霉菌和雜色曲霉的抑制作用，證實(shí)丁香∶八角∶薄荷∶花椒=1∶1∶1∶1復(fù)合精油對(duì)上述霉菌均有抑制作用，對(duì)青霉菌的抑制作用最為顯著。且復(fù)合精油均高于霉菌對(duì)相同劑量的單種精油的敏感度（王利敏等，2018）。由于精油經(jīng)過一定體積比的復(fù)合后可以起到協(xié)同增效的作用，而得到比單種精油更好地抑菌效果（代安娜等，2021）。本研究通過抑菌圈、最低抑制濃度的測(cè)定，聯(lián)合抑菌評(píng)價(jià)，在6 種植物精油中篩選出對(duì)霉菌有較好抑制作用的山蒼子植物精油。并發(fā)現(xiàn)復(fù)合精油的抑菌效果比單方精油的抑菌效果好，小茴香精油和山蒼子精油以1:5 比例混合時(shí)對(duì)飼料霉菌具有最佳抑制效果。因此，該復(fù)合精油可用作天然飼料防霉劑。