安佳星，龍秀鋒，伍時華，曾令杰，黃錦翔，豐丕雪，易 弋

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

由于化石能源在使用過程中引起的環(huán)境問題，使綠色生物能源越來越受到人們的關注。燃料乙醇作為一種重要的清潔可再生能源，以其循環(huán)經濟、環(huán)境友好等優(yōu)點，已迅速發(fā)展成為全球可再生能源領域的戰(zhàn)略性新興產業(yè)[1]。但國內大部分地區(qū)主要以玉米、甘蔗等糧食作物為原料生產燃料乙醇[2]，而這些作物的供應有限，會導致燃料乙醇生產與糧食供應之間產生競爭。木質纖維素[3]主要由纖維素、半纖維素和木質素構成，是世界上儲量最豐富的碳水化合物資源，若將木質纖維素用于生產燃料乙醇，將更有利于節(jié)約經濟成本，實現可持續(xù)發(fā)展[4]。在以木質纖維素為原料的燃料乙醇生產過程中，經預處理和水解盡管提高了木質素的降解率[5-6]，增加了纖維素和半纖維素的含量，但也產生了大量的抑制物，如弱酸類、呋喃類、酚類化合物，這些物質的存在會對酵母生長造成一定影響[7]。

對羥基苯甲醛（p-hydroxybenzaldehyde，pb）和阿魏酸（ferulic acid，fer）是木質纖維素水解液中的主要酚類化合物，其毒性作用強于水解液中的其他酚類抑制物。為探明這兩種抑制物對釀酒酵母的毒性，通過測定pb和fer處理后釀酒酵母的生長情況、細胞形態(tài)、細胞膜通透性、海藻糖含量、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析等，初步了解抑制物對釀酒酵母的破壞程度，以期為揭示pb和fer對釀酒酵母的毒性機理以及培育耐受性菌株提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF16由廣西科技大學發(fā)酵工程研究所提供；pb、fer、醋酸鋇、間苯二酚、硫脲 上海麥克林生化科技有限公司；D-海藻糖、蒽酮 北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸西隴科學股份有限公司；戊二醛 天津市科密歐化學試劑有限公司；所有溶劑均為國產分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Alpha1-2LDplus真空冷凍干燥機 德國Christ公司；456-GC氣相色譜儀 天美創(chuàng)科儀器（北京）有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀 濟南延和生物科技有限公司；Phenom飛納臺式掃描電鏡 復納科學儀器（上海）有限公司；PerkinElmer FTIR儀（Frontier）興和儀器（上海）有限公司；UV-8000S紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；H2100R低溫高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；HH系列數顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ZWYRC2402C疊式恒溫調速搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌菌懸液制備

從YPD平板上挑取釀酒酵母GGSF16單菌落到YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)活化，調整菌液濃度為108CFU/mL，備用。

1.3.2 pb和fer對細胞生長的影響

按10%接種量，將酵母菌菌懸液接種到200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在無菌操作下將pb和fer加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別制成0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 g/L質量濃度梯度，以未添加pb和fer的菌液為對照組，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)，測定樣品在600 nm波長處OD值，每隔2 h測一次，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.3 pb和fer對糖代謝和乙醇發(fā)酵的影響

按照1.3.2節(jié)方法，將pb和fer分別制成1.0 g/L和1.25 g/L質量濃度，以未添加pb和fer的菌液為對照組，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取上清液，適當稀釋，用生物傳感分析儀測定發(fā)酵過程中葡萄糖質量濃度，用氣相色譜儀測定發(fā)酵過程中乙醇質量濃度，實驗重復3 次。

1.3.4 pb和fer對細胞膜通透性的影響

按10%接種量，將酵母菌菌懸液接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，將100 mL菌液（菌液濃度107CFU/mL）加入含有pb和fer的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，使pb和fer的終質量濃度分別為1.0 g/L和1.25 g/L。30 ℃、160 r/min培養(yǎng)4 h，5 000 r/min離心10 min，參考Dai Chunhua等[8]方法，分別在260 nm和280 nm波長處測定上清液OD值，表示核酸和蛋白質含量，實驗重復3 次。

1.3.5 pb和fer對胞內海藻糖含量的影響

1.3.5.1 海藻糖標準曲線

配制0.1 mg/mL的海藻糖母液，稀釋成0.01～0.09 mg/mL海藻糖標準液，以水為空白對照。每個樣品取1 mL于具塞比色管中，加入5 mL硫酸-蒽酮試劑，混勻后沸水浴10 min，立即放入冰水浴中冷卻，測定樣品的OD620nm。

1.3.5.2 胞內海藻糖含量的測定

按照1.3.4節(jié)方法，取兩份培養(yǎng)液各5 mL，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用水洗滌3 次，其中一份烘干稱質量，另一份加入4 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液重懸菌體，冰浴1.5 h，期間每隔15 min上下顛倒混勻，萃取結束后10 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL，加入5 mL硫酸-蒽酮試劑，混勻后置于沸水浴10 min，立即放入冰水浴中冷卻，測定OD620nm，實驗重復3 次。

1.3.6 分子結構的FTIR分析

采用FTIR法[9]對酵母分子結構的變化進行分析，按照1.3.4節(jié)方法獲得培養(yǎng)液，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3 次，真空冷凍干燥后用FTIR儀對干燥酵母細胞進行分析。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

參考文獻[10-11]方法，觀察酵母菌在pb和fer脅迫下的細胞形態(tài)變化。按照1.3.4節(jié)方法獲得培養(yǎng)液，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，向沉淀細胞中加入2.5%戊二醛溶液1 mL，4 ℃過夜固定，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用20%～100%的乙醇溶液脫水處理，5 000 r/min離心10 min收集菌體，真空冷凍干燥后噴金，用掃描電子顯微鏡觀察酵母菌的形態(tài)變化。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用Origin Pro 9.1軟件（單因素方差分析）和Graphpad Prism 8.0.1軟件對數據進行顯著性分析和圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 pb和fer對細胞生長的影響

由圖1可以看出，對照組的酵母生長速率較高，在開始的8 h內迅速生長，之后趨于穩(wěn)定，而從圖1A可以看出，隨著pb質量濃度的增加，對釀酒酵母的抑制作用越來越明顯，當pb質量濃度為2.0 g/L時，釀酒酵母的生長被完全抑制，為保證后續(xù)的分析，選取pb質量濃度為1.0 g/L。如圖1B所示，fer質量濃度不高于1.5 g/L時，對數生長期延長[12-13]，在穩(wěn)定期的OD值比對照組低，但釀酒酵母的生長曲線沒有產生很明顯的分離現象，而當fer質量濃度高于1.75 g/L時，釀酒酵母的OD值突然降低，說明fer質量濃度在1.75 g/L以上時，酵母的生長會受到明顯的抑制，由圖1B也可以看出，fer質量濃度在2.0 g/L時，釀酒酵母的生長被完全抑制，為保證后續(xù)的分析，選取fer質量濃度為1.25 g/L。

圖1 pb（A）和fer（B）對釀酒酵母生長的影響Fig.1 Effects of p-hydroxybenzaldehyde (A) and ferulic acid (B) on the growth of S.cerevisiae

2.2 pb和fer對釀酒酵母糖代謝及乙醇含量的影響

釀酒酵母利用葡萄糖可以產生乙醇，而pb和fer的添加會抑制酵母菌的生長從而抑制葡萄糖的消耗及乙醇的生成。由圖2可知，對照組在6～10 h葡萄糖消耗較快，第12小時葡萄糖基本消耗完全，乙醇在6～10 h產量較多，并在第12小時趨于平緩。而在釀酒酵母中添加1.25 g/L fer后葡萄糖消耗延遲為6～12 h，14 h葡萄糖基本消耗完全，乙醇的快速生成延遲為6～12 h，之后乙醇生成緩慢增長，基本達到對照組的乙醇產量。當在釀酒酵母中添加1.0 g/L pb后葡萄糖消耗延遲為6～16 h，16 h葡萄糖基本消耗完全，乙醇在6～16 h呈指數形式快速產生，并在第16小時基本達到對照組乙醇含量。因此，1.25 g/L的fer對細胞抑制作用略低于1.0 g/L的pb。

圖2 pb和fer脅迫下釀酒酵母葡萄糖含量及乙醇產量變化曲線Fig.2 Changes in glucose content and ethanol production of S.cerevisiae under p-hydroxybenzaldehyde or ferulic acid stress

2.3 pb和fer對釀酒酵母細胞膜通透性的影響

從表1可以看出，與對照組相比，pb處理后釀酒酵母的核酸和蛋白質釋放量分別增加58.1%和37.6%，fer處理后釀酒酵母的核酸和蛋白質釋放量分別增加47.7%和12.0%，通過比較發(fā)現，OD260nm比OD280nm增加更為明顯，可能是因為核酸的相對分子質量比蛋白質小，核酸比蛋白質更容易透過細胞膜。

表1 胞外DNA和蛋白質含量Table 1 Effect of p-hydroxybenzaldehyde and ferulic acid on extracellular DNA and protein contents of S.cerevisiae

2.4 pb和fer對胞內海藻糖含量的影響

由圖3可以看出，與對照組相比，加入1.0 g/L pb和1.25 g/L fer在第0小時海藻糖含量沒有顯著變化；在第4小時海藻糖含量明顯增多，經pb處理后比對照組的海藻糖含量高約34.4%，fer處理后比對照組的海藻糖含量高約16.9%，可能原因是經pb和fer處理后，酵母細胞為應對外界環(huán)境的壓力，從而產生大量的海藻糖[14]。通過對比pb和fer處理后細胞的海藻糖含量變化，發(fā)現pb處理后的海藻糖含量比fer處理后的海藻糖含量高約15.0%，可能原因是pb對酵母的生長抑制比例比fer大，因此，pb處理后比fer處理后的胞內海藻糖含量多。

圖3 pb和fer對釀酒酵母海藻糖含量的影響Fig.3 Effects of p-hydroxybenzaldehyde and ferulic acid on intracellular trehalose content of S.cerevisiae

2.5 FTIR分析

根據前人的研究結果[15-17]，3 700 cm-1與3 000 cm-1之間有一較寬的吸收帶，是由于幾丁質中的羥基和仲胺中的N—H的伸縮振動引起；3 100～2 800 cm-1吸收峰為三酰基甘油中的脂肪酸?；淐H2的拉伸，代表脂質官能團；表征蛋白質最重要的譜帶是酰胺帶[18]，1 652、1 542、1 244 cm-1分別為酰胺I、II、III帶，其中1 652 cm-1吸收峰是C＝O的伸縮振動引起的，1 542 cm-1吸收峰是N—H變形振動和C—N伸縮振動的耦合振動峰，1 244 cm-1吸收峰是由N—H彎曲振動和C—N伸縮振動引起，是蛋白質的特征譜帶；1 078 cm-1左右的吸收峰為酵母中DNA、RNA、細胞壁中存在的碳水化合物或醇中的C—O伸縮振動峰；915 cm-1左右的吸收峰代表細胞壁多糖環(huán)鍵。

由圖4可知，與對照組相比，經pb和fer處理后釀酒酵母的特征峰變化較明顯，特征峰吸光度整體呈現增強趨勢，在3 315 cm-1處吸收峰面積增加，表明pb和fer改變了細胞壁中幾丁質的結構，使細胞的身體骨架發(fā)生改變，不能正常保護細胞；代表脂質的官能團在3 002 cm-1和2 930 cm-1處的吸光度均明顯增強，表明pb和fer改變?；湣狢H2—的拉伸，從而對酵母細胞膜的脂質產生破壞；在酰胺I帶峰的吸收強度有所增加，表明蛋白質二級結構中α-螺旋或無規(guī)卷曲增加，酰胺II帶峰的吸收強度增加，表明蛋白質分子間或分子內的氫鍵締合作用加強，而蛋白質是細胞壁、細胞膜的主要成分之一，因此，通過改變蛋白質的結構進而對酵母細胞壁和細胞膜產生影響；在1 072 cm-1處的吸光度明顯增強，說明pb和fer改變了核酸的結構；在914 cm-1處的吸收峰明顯增強，表明pb和fer改變了釀酒酵母表面的多糖羥基骨架，進而改變酵母細胞壁的結構。

圖4 pb和fer處理后FTIR圖Fig.4 FTIR before and after treatment with p-hydroxybenzaldehyde or ferulic acid

2.6 pb和fer對釀酒酵母細胞形態(tài)的影響

空白對照組（圖5A）酵母細胞圓潤飽滿、形態(tài)完整、表面光滑，并且彼此間無粘黏，經1.0 g/L pb處理組（圖5B）和1.25 g/L fer處理組（圖5C）作用后，酵母細胞形態(tài)上發(fā)生了較大變化。經pb處理后，細胞明顯變形，細胞壁嚴重脫落，細胞膜結構被破壞，增加細胞通透性，使細胞內容物泄漏，細胞外有大量的黏膜，細胞粘黏在一起，阻礙酵母蛋白質的正常表達，影響細胞的結構組成與酶的催化活性，進而導致酵母正常生理功能喪失[19]，造成部分菌體死亡；經fer處理后，細胞也明顯受到破壞，細胞表面褶皺變形，細胞壁塌陷，細胞呈黏連狀態(tài)。由結果可知，相對于fer處理組，pb處理后的釀酒酵母的形態(tài)有著更大的變化，在pb的作用下，釀酒酵母的細胞壁大量脫落，而失去細胞壁保護的酵母可能使更多的成分暴露于外膜（如蛋白質、脂質），細胞因不能正常生長而死亡。

圖5 pb和fer處理后掃描電子顯微鏡圖Fig.5 SEM images of S.cerevisiae before and after treatment with p-hydroxybenzaldehyde or ferulic acid

3 討 論

木質纖維素經預處理會產生許多酚類抑制物，這些物質的存在會抑制酵母細胞生長、底物利用、產物合成以及影響酵母細胞膜通透性，從而大大降低木質纖維素發(fā)酵產乙醇的生產效率。pb和fer作為木質纖維素預處理水解液中毒性較強的酚類抑制物，添加到釀酒酵母中無疑會抑制細胞生長和乙醇的生成[20]。經驗證，1.0 g/L的pb和1.25 g/L的fer嚴重抑制酵母的生長，并且乙醇的發(fā)酵時間明顯延長。Yan Yu等[21]在香草醛存在下野生型梭狀芽孢桿菌BOH3出現自聚集，與對照組相比，在6.6 mmol/L香草醛的存在下，丁醇產量降低了（15.58±0.66）%。Xu Hongtao等[12]通過研究發(fā)現，0.5 g/L的香蘭素可以抑制67%的谷氨酸棒桿菌生長，而0.5 g/L的丁香醛可以完全抑制谷氨酸棒桿菌的生長。Pereira等[13]認為，枯草芽孢桿菌不能在高于0.5 g/L的丁香醛環(huán)境下生長，在所選的抑制物中，香蘭素對酵母的抑制作用最大，在1.5 g/L時其生長速率降低了95%。

細胞膜作為生物與外界環(huán)境接觸的屏障，具有維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、確保物質正常運輸的功能[22]。當細胞膜遭到破壞時，胞內的一些磷酸鹽、碳酸鹽、DNA、RNA等均會先后從細胞膜中釋放出來。經pb和fer處理后，釀酒酵母的核酸和蛋白質釋放量均顯著增加（P＜0.05），且pb處理組的釋放量比fer大，可能是由于pb對酵母的生長抑制作用比fer大造成。這與周倩倩等[23]研究丁香酚使腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌紫外吸收物質泄漏的結論相似。海藻糖是已被認為的抵抗多種不利環(huán)境變換的一種保護性細胞內代謝物，為研究酵母細胞對代謝水平的應激反應，確定海藻糖含量的變化是必要的[24-25]。Guo Zhongpeng等[26]研究表明，暴露于弱酸環(huán)境下的酵母細胞中海藻糖含量會顯著提高。本研究結果表明，經pb和fer處理后釀酒酵母的海藻糖含量均顯著增加（P＜0.05）。

FTIR可以反映pb和fer加入后釀酒酵母的分子組成變化[27]。Sayqal等[28]認為甲苯脅迫對惡臭假單胞菌的最顯著影響與蛋白質和脂質成分變化有關。本研究結果表明，經pb和fer處理后釀酒酵母代表脂質、蛋白質、核酸等分子成分官能團發(fā)生變化，結合掃描電子顯微鏡，可以直觀看出經pb和fer處理后細胞的結構變化，并且本研究結果與Jeyanthi等[29]報道的通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡分析確定甲氧西林誘導金黃色葡萄球菌超微結構變化相似。

4 結 論

根據添加不同質量濃度pb和fer的釀酒酵母生長曲線可知，1.0 g/L pb和1.25 g/L fer能明顯抑制釀酒酵母的生長。經1.0 g/L pb和1.25 g/L fer處理均能使釀酒酵母糖代謝和乙醇發(fā)酵時間延長，且pb處理組的延長時間較fer處理組延長時間更長。pb和fer處理后會破壞酵母細胞膜，使核酸、蛋白質泄漏到細胞外，導致細胞無法進行正常的生命活動而死亡，為應對外界環(huán)境變化對酵母細胞造成影響，處理后的胞內海藻糖含量均明顯提高。從pb和fer處理前后的掃描電子顯微鏡圖像可以看出，原本光滑完整的細胞出現褶皺、粘黏現象，并伴有細胞壁的脫落，結合FTIR呈現的代表脂質、蛋白質、核酸等分子成分基團的變化，進一步說明了pb和fer對釀酒酵母的毒性，為揭示pb和fer對釀酒酵母的毒性機理以及培育耐受性菌株提供依據。