李海利，徐引弟，游 一，朱文豪，張青嫻，焦文強(qiáng)，王治方，許 峰，王克領(lǐng)，郎利敏，張立憲，鄒 靖

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；2. 河南省信陽(yáng)市畜牧工作站，河南信陽(yáng) 464000）

牛支原體肺炎是由牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）引起牛的一種高度接觸性傳染性呼吸道疾病[1]，其感染可導(dǎo)致牛生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、飼料利用率降低、咳嗽、呼吸困難、高燒、喘氣等，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，牛支原體可引起免疫抑制，并因此導(dǎo)致其他呼吸道病原（如巴氏桿菌、鏈球菌）的混合或繼發(fā)感染，使損失更加嚴(yán)重。牛支原體除可引起呼吸道疾病外，還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、眼角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎及流產(chǎn)與不孕等多種疾病[2?5]。牛支原體肺炎首次于1961 年在美國(guó)發(fā)生[6?7]，當(dāng)時(shí)從患乳腺炎的牛乳中分離到牛支原體病原[8?9]，其他國(guó)家也相繼發(fā)生并暴發(fā)了牛支原體肺炎。湖北是我國(guó)首先發(fā)生牛支原體肺炎的省份，隨后在全國(guó)流行。目前，牛支原體肺炎在世界范圍內(nèi)流行[10?12]，發(fā)病率和死亡率均較高。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸后的奶?；蛘呷馀?，更易誘發(fā)牛支原體肺炎，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失[13?16]。

蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能和生命活動(dòng)的重要載體，也是生物體內(nèi)遺傳信息表達(dá)的最后形式。利用微生物主要免疫保護(hù)蛋白或者相應(yīng)抗原制備亞單位苗或者基因工程疫苗，是動(dòng)物疫病防控的研究方向之一。iTRAQ 差異蛋白質(zhì)組學(xué)是目前常用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具，可以鑒定出生物體內(nèi)幾乎所有的蛋白質(zhì)。目前應(yīng)用較多的是iTRAQ 定量差異蛋白質(zhì)組學(xué)，可以鑒定生物體或者微生物不同時(shí)間內(nèi)的差異蛋白質(zhì)，為揭示生命現(xiàn)象規(guī)律提供新的方法和思路。

隨著規(guī)?；B(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，當(dāng)前牛支原體肺炎已成為牛的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病，并常常發(fā)生混合感染。牛支原體隱性持續(xù)感染，是牛場(chǎng)呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生的根本原因，是當(dāng)前呼吸系統(tǒng)疾病的主要病因。牛肺炎支原體可在牛群中水平傳播，也可垂直傳播，必須采取綜合防控措施。目前，牛支原體肺炎主要采取藥物治療，但是藥物防治只能緩解癥狀和降低經(jīng)濟(jì)損失，難以徹底凈化。因此，人們嘗試通過(guò)疫苗接種來(lái)防治牛支原體的感染，研發(fā)用于牛支原體肺炎的預(yù)防、診斷和控制的新方法、新策略迫在眉睫，為牛支原體肺炎防控提供保障。采用iTRAQ 差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，以臨床分離的菌株HN12 和標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)G45 的全蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，對(duì)牛支原體全譜蛋白質(zhì)及差異蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，旨在為研發(fā)中支原體蛋白質(zhì)疫苗或研究其致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 牛支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株（PG45）；臨床分離牛支原體菌株（HN12）[17]，來(lái)源于河南地區(qū)某養(yǎng)牛場(chǎng)肺臟。

1.1.2 主要試驗(yàn)儀器 質(zhì)譜儀AB SCIEX Nano LC/MS/MS（Triple TOF 5600 Plus）。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇培養(yǎng)及保存 把標(biāo)準(zhǔn)菌株（PG45）和臨床分離菌株（HN12）接種于PPLO 瓊脂平板上，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

挑取單菌落置于PPLO 液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，4 000 r/min離心30 min，棄上清液，收集菌體，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)提取及定量 取-80 ℃冷凍保存菌體，在菌體中加入適量裂解液（8 mol/L 尿素、1%SDS）；漩渦振蕩混勻，置于冰上超聲4 min，冰上裂解30 min；4 ℃離心30 min，取上清。上清采用Bradford法定量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 酶解和標(biāo)記及質(zhì)譜分析 取經(jīng)過(guò)定量的蛋白質(zhì)上清，使樣品中的蛋白質(zhì)含量為100 μg，進(jìn)行酶解標(biāo)記及質(zhì)譜分析，顯著性差異蛋白質(zhì)數(shù)目按照P<0.05、差異倍數(shù)（FC）<0.5 或>2.0 條件篩選，質(zhì)譜分析在武漢金開(kāi)瑞公司進(jìn)行。對(duì)鑒定出的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛支原體蛋白質(zhì)的提取及含量測(cè)定

采用TCA-丙酮法對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取。選擇常規(guī)的Bradford 定量方法測(cè)定總蛋白質(zhì)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得曲線方程為y=0.006+0.025x，R2=0.997。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的含量（表1）。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖1）。從圖1可以看出，提取的蛋白質(zhì)電泳條帶清晰，符合下一步質(zhì)譜分析需求，臨床分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株在個(gè)別條帶處存在明顯差異。

圖1 牛支原體臨床分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株蛋白質(zhì)SDSPAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of protein from the clinical isolate and standard isolate of Mycoplasma bovis

表1 樣品蛋白質(zhì)含量Tab.1 Protein concentration of sample

2.2 牛支原體蛋白質(zhì)鑒定信息

經(jīng)iTRAQ 標(biāo)記及質(zhì)譜分析，從HN12 和PG45 菌株中共鑒定出2 402 個(gè)蛋白質(zhì)，存在顯著差異的有66 個(gè)。其中，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，臨床分離菌株上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為25個(gè)（表2），下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為41個(gè)（表3）。上調(diào)蛋白質(zhì)主要為無(wú)特征的蛋白質(zhì)、超家族蛋白的水解酶、假定的膜蛋白、纈氨酸連接酶、轉(zhuǎn)座酶家族蛋白、假定的脂蛋白、依賴DNA 的RNA 聚合酶β 亞基、無(wú)機(jī)焦磷酸酶、50 S 核糖體蛋白L10、跨膜蛋白、果糖三磷酸醛縮酶、50 S 核糖體蛋白L14、三甲胺脫氫酶、轉(zhuǎn)座酶、磷酸甘油酸酯激酶、延長(zhǎng)因子、30S 核糖體蛋白S10、酰胺酶、尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷?；D(zhuǎn)移酶、50 核糖體蛋白L13、磷酸酯酶家族蛋白。下調(diào)蛋白質(zhì)主要為亮氨酰氨基肽酶、乙醇脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E1-β 亞基、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、延長(zhǎng)因子Tu、膜脂蛋白P81、延長(zhǎng)因子Ts、丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E1-β亞基、50 S 核糖體蛋白L11、50 S 核糖體蛋白L7/L12、依賴ATP 的鋅金屬蛋白酶FtsH、伴護(hù)蛋白質(zhì)DnaK、氧化還原酶鋅結(jié)合脫氫酶、L-乳酸脫氫酶、LemA 家族蛋白、變量表面脂蛋白、假定的脂蛋白、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 結(jié)合蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶無(wú)特征的蛋白質(zhì)、假定底物結(jié)合蛋白、ATP 合成酶亞基β 蛋白、磷酸戊糖變位酶、30S 核糖體蛋白S7、二氫利坡酰胺琥珀酰（酸）轉(zhuǎn)移酶、烯醇酶、乙醇脫氫酶、磷酸戊糖變位酶、可變表面脂蛋白VspF、膜脂蛋白P81、二氫硫辛酸脫氫酶、NADH 氧化酶、延長(zhǎng)因子G、假定的脂蛋白、NADH脫氫酶等。

表2 牛支原體中鑒定出的上調(diào)蛋白質(zhì)Tab.2 The identified upregulated proteins of Mycoplasma bovis

表3 牛支原體中鑒定出的下調(diào)蛋白質(zhì)Tab.3 The identified down-regulated proteins of Mycoplasma bovis

續(xù)表3 牛支原體中鑒定出的下調(diào)蛋白質(zhì)Tab.3（Continued） The identified down-regulated proteins of Mycoplasma bovis

2.3 牛支原體蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

2.3.1 全譜分析 依據(jù)分子功能、細(xì)胞組分和參與的生物學(xué)過(guò)程，將定量得到的2 402 個(gè)牛支原體蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋（圖2）。從圖2 可以看出，分子功能的蛋白質(zhì)主要參與核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、結(jié)合、運(yùn)輸活動(dòng)、催化活性等，其中結(jié)合功能的蛋白質(zhì)最多。細(xì)胞組分包括的蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞器、細(xì)胞組分、細(xì)胞膜組分、大分子復(fù)合物等，其中參與細(xì)胞組分的蛋白質(zhì)最多。生物學(xué)過(guò)程蛋白質(zhì)主要參與生物過(guò)程調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成、組織或生物形成、代謝過(guò)程和生物代謝過(guò)程等，其中參與代謝過(guò)程的蛋白質(zhì)最多。

圖2 牛支原體蛋白質(zhì)的GO二級(jí)分類統(tǒng)計(jì)Fig.2 GO secondary classification statistics of Mycoplasma bovis protein

2.3.2 KEGG 注釋通路分析 對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)目最多的前20個(gè)通路進(jìn)行分析，了解蛋白質(zhì)和基因的生物學(xué)功能（圖3）。從圖3 可以看出，包含蛋白質(zhì)最多的前20 個(gè)通路為核糖體、轉(zhuǎn)氨?；锖铣?、糖酵解和糖異生、嘌呤代謝、嘧啶代謝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、丙酮酸代謝、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、同源重組、光合生物碳固定、RNA 降解、甲烷代謝、光合作用、DNA 復(fù)制、RNA 聚合酶、視黃醇代謝、錯(cuò)配修復(fù)蛋白質(zhì)輸出和丙酸乙酯代謝。其中包含蛋白質(zhì)最多的通路為核糖體通路。

圖3 牛支原體蛋白質(zhì)KEGG注釋通路Fig.3 KEGG annotation pathway of Mycoplasma bovis proteins

2.3.3 差異蛋白質(zhì)表達(dá)模式聚類分析和差異蛋白質(zhì)模塊表達(dá)趨勢(shì)分析 用R 語(yǔ)言中g(shù)plot 包將牛支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株與臨床分離菌株差異顯著的蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)模式聚類分析（圖4）和模塊（Cluster）表達(dá)趨勢(shì)折線分析（圖5）。從圖4 可以看出，41 個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)菌株中的表達(dá)量高于臨床分離菌株中的表達(dá)量，其中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、NADH氧化酶和延長(zhǎng)因子G的差異倍數(shù)分別為0.48、0.48、0.48、0.47 和0.46；25 個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)在臨床分離菌株中的表達(dá)量高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中，30S 核糖體蛋白S10、延長(zhǎng)因子、假定的脂蛋白和假定的膜蛋白的差異倍數(shù)分別為10.76、9.80、6.25和4.04。

圖4 牛支原體差異蛋白質(zhì)表達(dá)模式聚類Fig.4 Clustering diagram of differential protein expression of Mycoplasma bovis

圖5 中，模塊1 為21 個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)（2.0<差異倍數(shù)<4.0）表達(dá)趨勢(shì)，其在臨床分離菌株中的表達(dá)量高于標(biāo)準(zhǔn)菌株；模塊2為30個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)（0.2<差異倍數(shù)<0.5）的表達(dá)趨勢(shì)，其在臨床分離菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)量低于標(biāo)準(zhǔn)菌株中的表達(dá)量；模塊3 為3 個(gè)上調(diào)蛋白質(zhì)（6.0<差異倍數(shù)<10.0）的表達(dá)趨勢(shì)，其在臨床分離菌株中的表達(dá)量高于標(biāo)準(zhǔn)菌株；模塊4 為11 個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)（0.1<差異倍數(shù)<0.2）的表達(dá)趨勢(shì)，這11個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)在臨床分離菌株中的表達(dá)量低于標(biāo)準(zhǔn)菌株。

圖5 牛支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株與臨床分離菌株差異蛋白質(zhì)模塊表達(dá)趨勢(shì)Fig.5 Expression trend of differential protein modules between the standard strains and clinical isolate of Mycoplasma bovis

3 結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究是生命科學(xué)領(lǐng)域常用的工具，具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)挖掘功能，幾乎能把樣本中的所有蛋白質(zhì)都鑒定出來(lái)[18?19]，是目前研究免疫原性蛋白質(zhì)功能性蛋白、診斷試劑、疫苗候選抗原常用的技術(shù)手段[20?23]。本研究應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)牛支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，共鑒定差異蛋白質(zhì)66個(gè)。鑒定出的上調(diào)蛋白質(zhì)主要有超家族蛋白的水解酶、延長(zhǎng)因子等，下調(diào)蛋白質(zhì)主要有亮氨酰氨基肽酶、乙醇脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E1-β亞基、膜脂蛋白P81、延長(zhǎng)因子Ts、丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E1-β 亞基等。牛支原體細(xì)胞膜表面含有大量的變量表面脂蛋白[24?25]。表面脂蛋白C 端具有抗原決定簇和黏附結(jié)構(gòu)。本研究鑒定出的表面脂蛋白在臨床分離株中明顯下調(diào)。

前人研究表明，牛支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)G45 共編碼765個(gè)蛋白質(zhì)[26?30]。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E1-β亞基、延長(zhǎng)因子、膜脂蛋白P81、延長(zhǎng)因子Ts等，在臨床分離菌株中明顯下調(diào)。延長(zhǎng)因子是原核細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中所需的因子[31]，本研究共鑒定2 種延長(zhǎng)因子，即延長(zhǎng)因子G 和延長(zhǎng)因子Ts[32?33]。前人研究表明，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E1-β 亞基是牛支原體重要的免疫原性蛋白質(zhì)，可用于牛支原體的診斷和疫苗研究[34?36]。

本研究通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)G45 與臨床分離菌株HN12 之間的蛋白質(zhì)差異。共鑒定2 402個(gè)蛋白質(zhì)，存在顯著差異的有66個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)菌株相對(duì)于臨床分離菌株上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為25個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為41個(gè)。其中鑒定出多個(gè)免疫原性蛋白質(zhì)，為牛支原體抗原的篩選和診斷提供參考，為牛支原體病防控和基因工程亞單位疫苗的篩選提供了重要的蛋白質(zhì)信息，也為診斷試劑、新藥物及疫苗研發(fā)提供依據(jù)。