宋敏杰，周小雙，石勝麗，朱文文，田文靜，程相朝，郁 川，

（1. 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院寵物與人類健康工程技術(shù)中心，河南洛陽 471900；2. 河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471023；3. 新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新鄉(xiāng) 453000）

雞新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種對家禽業(yè)發(fā)展危害嚴(yán)重的傳染病[1]，其防治一直受到業(yè)界的廣泛關(guān)注。近年來，被發(fā)現(xiàn)的NDV 基因型種類越來越多，ND 在我國的流行形勢也越來越嚴(yán)重，給我國家禽業(yè)養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。NDV 為副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬成員，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA 病毒，其基因組編碼6種病毒結(jié)構(gòu)蛋白[3]，分別為核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷酸化蛋白（Phsphorylated protein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（Hemagglutinin?neuraminidase protein，HN）及依賴RNA 的RNA 聚合酶（L）。HN 蛋白是NDV 粒子重要的免疫原性蛋白和毒力因子，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，使之具有宿主保護(hù)性[4?5]。因此，NDV HN蛋白是目前研究新城疫DNA疫苗的首要選擇，為ND的防控及新型疫苗的研制提供了新思路。

減毒活疫苗因其具有很好的安全性，是良好的載體和天然免疫佐劑，備受醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)的廣泛關(guān)注[6?8]。鼠傷寒沙門菌為胞內(nèi)侵襲性菌，通過基因工程方法減毒后不影響其侵襲能力，攜帶質(zhì)粒DNA 的細(xì)菌在抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)發(fā)生溶解或以宿主吞噬小體進(jìn)入胞質(zhì)，并將DNA 釋放到細(xì)胞核，從而使抗原基因在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，并誘導(dǎo)相應(yīng)的細(xì)胞免疫和體液免疫。減毒沙門菌作為活疫苗本身具有免疫佐劑的作用，通過口服可誘導(dǎo)黏膜免疫[9?10]。沙門菌外膜蛋白E（Salmonellaouter protein E，SopE）是Ⅲ型分泌系統(tǒng)的功能蛋白，能高效運(yùn)輸外源蛋白，促使沙門菌內(nèi)化到宿主細(xì)胞中[11]。以SopE 蛋白為基礎(chǔ)構(gòu)建的減毒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲsecretion system，T3SS）能夠有效遞呈外源抗原，該重組菌株有潛力作為安全、穩(wěn)定、高效表達(dá)外源基因的口服重組活疫苗載體[12]。基于Ⅲ型分泌蛋白SopE 的這一特點(diǎn)，河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了能穩(wěn)定攜帶外源抗原的新型減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌表達(dá)系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA-sopENt100），并將egfp標(biāo)記基因克隆入SopE基因下游，結(jié)果顯示，其能有效遞呈增強(qiáng)綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）[13]。

為了探索以減毒沙門菌為載體的新城疫口服疫苗，利用減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100），構(gòu)建能穩(wěn)定攜帶NDVHN基因的重組菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN），并研究其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究其免疫活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)菌

質(zhì)粒（pMD19-T）、大腸桿菌χ6097、減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344、減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）均由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨、酵母浸出物、瓊脂糖、瓊脂粉、NaCl均購自生工生物（上海）股份有限公司；Taq聚合酶、Marker、dNTP、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ均購自Takara 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自AxyPrep公司。

1.3 引物

根據(jù)GenBank 已經(jīng)登錄的NDV La Sota 株的HN基因序列（AO3663.1），利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，并送至通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。HN基因特異性引物序列：上游引物5′-CTGGATCCATGGACCGCGCCGTTAGC-3′，下劃線堿基為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)；下游引物5′-CGAAGCTTCTAGCCAGACCTGGCTTC-3′，下劃線堿基為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

1.4 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN的構(gòu)建與鑒定

以pMD19-T 為載體，利用HN引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將反應(yīng)完成的PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。將回收所得的目的片段與pMD19-T載體相連接并轉(zhuǎn)化，最后挑取單菌落質(zhì)粒進(jìn)行Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定。

1.5 表達(dá)載體pYA3493-sopENt100-HN 的構(gòu)建與鑒定

將鑒定正確的pMD19-T-HN和pYA3493-sopENt100分別用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切，電泳回收目的片段并進(jìn)行連接，然后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌χ6097，挑取單菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定。

1.6 重組菌株Δ crp Δ asd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的構(gòu)建與鑒定

將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344，挑單菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定。

1.7 重組菌株生物學(xué)特性研究

1.7.1 生長特性分析 挑菌株Δcrp ΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）、ΔcrpΔasdSL1344、SL1344和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）單菌落過夜培養(yǎng)，用PBS 稀釋至合適稀釋度，取100 μL 涂板計(jì)數(shù)，推算母液濃度。將4 種菌株母液均稀釋至1×106cfu/mL 后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h 取菌液測OD600，并繪制生長曲線。

1.7.2 遺傳穩(wěn)定性分析 將重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）接種于LB 固體平板，連續(xù)傳代50 代，挑第10、20、30、40、50 代單菌落進(jìn)行HN基因PCR鑒定，分析其遺傳穩(wěn)定性。

1.7.3 表達(dá)特性分析 將重組菌株感染CEF 細(xì)胞[14]，于感染后48 h 收集蛋白質(zhì)，Western blot 分析HN蛋白在體外CEF細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.7.4 毒力特性分析 挑重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）、ΔcrpΔasdSL1344、SL1344 和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）單菌落過夜培養(yǎng)，PBS 稀釋至合適稀釋度后取100 μL 涂板計(jì)數(shù)，由此推算母液的濃度。將4 種菌株母液均稀釋至合適濃度后，每只雞口服200 μL進(jìn)行免疫試驗(yàn)，每組10只，另設(shè)PBS 對照組，統(tǒng)計(jì)30 d內(nèi)雞只的存活數(shù)據(jù)，運(yùn)用Bliss生物軟件計(jì)算其LD50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN的鑒定

挑取pMD19-T-HN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 和酶切鑒定。PCR 檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒能成功擴(kuò)增出1 700 bp 左右的目的片段（圖1A）；用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切后可見2 600 bp 左右的載體片段和1 700 bp 左右的目的片段（圖1B）。均與預(yù)期片段大小一致，說明重組質(zhì)粒pMD19-T-HN構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒PMD19-T-HN的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pMD19-T-HN

2.2 重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN的鑒定

挑取轉(zhuǎn)化菌株單菌落提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 和酶切鑒定。PCR 檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒能成功擴(kuò)增出1 700 bp 左右的目的片段（圖2A），限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ對重組載體pYA3493-sopENt100-HN進(jìn)行雙酶切后可見3 400 bp 左右的pYA3493-sopENt100載體條帶和1 700 bp 左右的HN目的條帶（圖2B），與預(yù)期片段大小一致，說明重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN的構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN的鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pYA3493-sopENt100-HN

2.3 重組菌株Δ crp Δ asd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的鑒定

挑取重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）單菌落提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 和酶切鑒定。PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒能成功擴(kuò)增出1 700 bp 左右的目的片段（圖3A），限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切后可見3 400 bp 左右的pYA3493-sopENt100載體片段和1 700 bp 左右的目的片段（圖3B）。說明重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN成功導(dǎo)入減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344。

圖3 重組菌株ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的鑒定Fig.3 Identification of the recombinant strain ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）

2.4 重組菌株生物學(xué)特性分析

2.4.1 生長特性 將重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN） 、Δ crp Δ asdSL1344（PYA3493）、SL1344 和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）稀釋至1×106cfu/mL后轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，每隔1 h測菌液的OD600值，并繪制生長曲線（圖4）。結(jié)果顯示，重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的生長趨勢與Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100）和Δ crp Δ asdSL1344 相似，與SL1344有明顯差異。

圖4 重組菌株ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）生長曲線（OD600）Fig.4 The growth curve of the recombinant strain ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）based on OD600

2.4.2 穩(wěn)定特性 重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）連續(xù)傳代50代后，挑第10、20、30、40、50 代進(jìn)行PCR 鑒定，電泳可見其均能擴(kuò)增出1 700 bp左右的HN基因片段，表明重組減毒鼠傷寒沙門菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）能夠穩(wěn)定遺傳HN基因（圖5）。

圖5 重組菌株ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）穩(wěn)定性檢測Fig.5 The stability test of the recombinant strain ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）

2.4.3 表達(dá)特性 重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）感染CEF細(xì)胞48 h后，收集蛋白質(zhì)做Western blot鑒定。結(jié)果顯示，重組菌株ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）感染CEF 細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)了sopENt100-HN蛋白，大小約為73 ku（圖6）。表明減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)能夠有效遞呈HN蛋白，并誘導(dǎo)其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

2.4.4 毒力特性 將重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）、ΔcrpΔasdSL1344、SL1344和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）稀釋至合適濃度后，每只雞口服200 μL 進(jìn)行免疫，每組10 只，統(tǒng)計(jì)存活數(shù)據(jù)，利用Bliss生物軟件計(jì)算LD50（表1）。從表1 可以看出，口服感染重組菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的LD50是2.08×1010cfu，感染互補(bǔ)菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100）的LD50是2.28×1010cfu，感染缺失菌ΔcrpΔasdSL1344 的LD50是2.53×1010cfu，感染親本菌株SL1344 的LD50是2.87×105cfu。可見，重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的LD50與ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）和ΔcrpΔasdSL1344 相差不大，與親本菌株SL1344差異較大。

表1 毒力特性分析Tab.1 Analysis of virulence characteristics

3 結(jié)論與討論

NDV 具有很強(qiáng)的傳染性和致病性，嚴(yán)重阻礙我國家禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[15?16]。隨著基因工程技術(shù)和分子克隆技術(shù)的快速發(fā)展，研究者在NDV疫苗免疫方面的研究已取得了一定的進(jìn)展。HN 蛋白是NDV傳染性和致病性的重要蛋白，被認(rèn)為是誘導(dǎo)宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)和刺激抗體產(chǎn)生的主要因子。研究發(fā)現(xiàn)，HN基因在真核表達(dá)載體中具有良好的穩(wěn)定性[17]。李旭鋒等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HN 重組蛋白在畢赤酵母中能穩(wěn)定表達(dá)，且純化產(chǎn)物純度較高、活性良好，具有糖基化修飾，NDV HN 蛋白具有很好的免疫原性。減毒沙門菌載體活疫苗相關(guān)研究顯示，減毒沙門菌經(jīng)口服免疫后可以定居在腸道相關(guān)淋巴組織，刺激抗原提呈細(xì)胞活化增殖，從而快速啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生特異性黏膜免疫、體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，在細(xì)菌[19]、病毒[20]和寄生蟲病原體[21?22]中抗原的傳遞和重組活載體疫苗的研究中，顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用的減毒鼠傷寒沙門菌Δcrp ΔasdSL344，在crp基因缺失的情況下，失去了腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白的編碼能力，故而失去了碳水化合物等的代謝能力，該基因缺失使沙門菌毒力顯著下降，在活疫苗的應(yīng)用中既安全又具有免疫原性[23]。在asd基因缺失的情況下，失去了編碼DAP 生物合成途徑中的必需酶天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶的能力，asd突變株若失去外源DAP，會(huì)由于不能形成完好的細(xì)胞壁而發(fā)生溶菌并引起死亡[24]。原核表達(dá)載體pYA3493 是一種含asd基因的互補(bǔ)質(zhì)粒，含有asd+基因的互補(bǔ)型菌可以在DAP-宿主中生存，故可大幅度提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)傳50 代后，經(jīng)PCR 鑒定，可擴(kuò)增出1 700 bp 左右的HN基因片段，表明重組減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）能夠穩(wěn)定遺傳HN基因，與賈艷艷等[26]報(bào)道的減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA-HN-VP2）的結(jié)果一致。

以SopE 蛋白為基礎(chǔ)的減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)逐漸引起研究者的關(guān)注，CHEN 等[12]利用減毒鼠傷寒沙門菌VNP20009 株表達(dá)日本血吸蟲Sj23LHDGST 二價(jià)抗原，并檢測其對血吸蟲的保護(hù)作用，結(jié)果表明，其構(gòu)建的減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)VNP20009[nirB-sopE（1-104）-Sj23LHDGST]，能夠分泌性表達(dá)Sj23LHDGST 并傳遞到巨噬細(xì)胞的胞漿中，顯著增加機(jī)體IL-12 和IFN-γ 的產(chǎn)生量，對日本血吸蟲的感染具有一定的免疫保護(hù)作用。本研究利用減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)以及asd平衡致死系統(tǒng)，成功構(gòu)建了攜帶NDVHN基因的減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）。對重組菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，重組菌的生長趨勢與互補(bǔ)菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）和缺失菌Δ crpΔasdSL1344 相似，與親本菌株SL1344 相比生長速度明顯減慢。此外，重組菌的毒力與互補(bǔ)菌和缺失菌相差不大，與親本菌株SL1344差異較大。其生長特性和毒力特性與石勝麗等[27]報(bào)道的鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100）相一致，說明HN基因的表達(dá)并沒有影響重組菌株的生物學(xué)特性。值得注意的是，重組菌株感染CEF 細(xì)胞后，可表達(dá)約73 ku 的sopENt100-HN 蛋白，證明減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)能有效向CEF 細(xì)胞遞呈NDVHN基因，并在該細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）生長穩(wěn)定，能夠有效遞呈HN基因，有潛力作為NDV 口服重組活疫苗候選菌株，可進(jìn)一步探究其免疫學(xué)特性，為開發(fā)安全、穩(wěn)定、高效的NDV活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。