李恭賀，陳秋玉，吳文德，鄭喜邦

（廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西南寧 530004）

瘦素（Leptin）是一種主要由白色脂肪組織合成和分泌的肽類(lèi)激素，在血漿中循環(huán)，與身體脂肪的分化密切相關(guān)[1]，主要作用是調(diào)節(jié)大腦對(duì)食物的攝入和新陳代謝[2?3]。近年來(lái)，肥胖癥和2 型糖尿病患病人群逐步上升，Leptin 在能量平衡中的生理作用引起了人們的關(guān)注[4]。正常狀況下機(jī)體血液中的Leptin 量與脂肪組織量呈正比[5]，是一種內(nèi)在的平衡。當(dāng)Leptin缺乏時(shí)，動(dòng)物就會(huì)出現(xiàn)多食、血糖升高及肥胖等癥狀[6?7]；相反，當(dāng)Leptin 增多時(shí)，動(dòng)物食欲下降，能量消耗增加[8]。奶牛的繁殖性能與leptin基因表達(dá)水平密切相關(guān)[9]，過(guò)高或過(guò)低水平的Leptin均對(duì)生殖產(chǎn)生不利影響，外源性L(fǎng)eptin 也會(huì)損害小鼠的血睪丸屏障完整性[10]。

廣西是我國(guó)飼養(yǎng)水牛最多的省份之一，多數(shù)屬于沼澤型。水牛體質(zhì)強(qiáng)健，適應(yīng)性強(qiáng)，但是繁殖力較低，水牛奶產(chǎn)量遠(yuǎn)不及黑白花牛。PANDA 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在體外添加Leptin 可提高水牛卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育能力，也有學(xué)者證明精子Leptin 與精子異常呈正相關(guān)，與精子濃度呈負(fù)相關(guān)[12]。CLEMENT[13]報(bào)道，Leptin 受體可在大腦的多個(gè)區(qū)域表達(dá)，其主要作用部位是下丘腦弓狀核，產(chǎn)生激素來(lái)控制生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)。目前，有關(guān)leptin基因的研究多集中在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物，而Leptin 參與調(diào)控水牛生殖和能量代謝方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，研究水牛leptin基因的表達(dá)及其融合蛋白的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步了解leptin基因功能及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒（Endo-Free Plasmid Midi Kit）購(gòu)自O(shè)mega 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ購(gòu)自Fermentas 公司；引物合成及DNA 測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；脂質(zhì)體2000 購(gòu)自Invitrogen 公司，DMEM 和胎牛血清為均Gibco 產(chǎn)品，Leptin 多克隆抗體（ab16227）和內(nèi)參β-actin多克隆抗體（ab8227）購(gòu)自Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 購(gòu)自北京天根生物科技公司；羊抗牛Leptin 酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑由美國(guó)Adlitteram Diagnostic Laboratories 提供；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、載體pMD18-T-leptin和pEGFP-N1 均由廣西大學(xué)獸醫(yī)臨床實(shí)驗(yàn)室克隆和保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)廣西大學(xué)獸醫(yī)臨床實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆的水牛leptin基因序列及pEGFP-N1載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分別引入內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和保護(hù)堿基，引物序列為lep-up：5′-CCCAAGCTTGCCATGCGCTGTG?GACCCCTGTAC-3′；lep-down：5′-CGCGGATCCC?GGCACCCGGGACTGAGGTCC-3′。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

純化leptin基因的PCR 產(chǎn)物，與載體pEGFP-N1經(jīng)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ分別雙酶切，將膠回收的目的片斷與線(xiàn)性化的pEGFP-N1 載體，用T4 DNA 連接酶在PCR 儀上22 ℃連接1 h。然后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單一菌落進(jìn)行擴(kuò)菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 重組質(zhì)粒EGFP-leptin在NIH/3T3細(xì)胞中表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒EGFP-leptin再次轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)菌，37 ℃條件下?lián)u菌16 h 左右，取10 mL培養(yǎng)的菌液進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素化提取質(zhì)粒（按Endo-Free Plasmid Midi Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。當(dāng)培養(yǎng)的NIH/3T3 細(xì)胞匯合達(dá)70%左右時(shí)，利用脂質(zhì)體2000 將EGFP-leptin轉(zhuǎn)染至NIH/3T3 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白細(xì)胞作陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染24～48 h后，用熒光顯微鏡觀(guān)察并記錄。

1.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株篩選

待瞬時(shí)轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)液為10%胎牛血清培養(yǎng)液（含雙抗）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，移去培養(yǎng)液，用生理鹽水清洗后經(jīng)胰酶消化并擴(kuò)大傳代培養(yǎng)24 h，加入0.4 g/L 的G418 進(jìn)行篩選。間隔3 d 換一次培養(yǎng)液，連續(xù)篩選3～5 周，直至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞克隆，再將單個(gè)細(xì)胞克隆斑轉(zhuǎn)至24 孔培養(yǎng)板，這時(shí)將G418 質(zhì)量濃度減半（0.2 g/L），繼續(xù)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞篩選，直至獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP-leptin的細(xì)胞株。

1.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的檢測(cè)

1.6.1 RT-PCR 檢測(cè) 將24 孔培養(yǎng)皿中克隆斑細(xì)胞移去培養(yǎng)液，加入裂解液2 mL，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄具體步驟根據(jù)反轉(zhuǎn)錄快速提取試劑盒（北京博邁德科技發(fā)展有限公司）說(shuō)明書(shū)操作。leptin基因PCR反應(yīng)體系如1.2所述。

1.6.2 Western blot 檢測(cè) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別用PBS 洗凈，加入裂解液，反復(fù)凍融3次，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，吸取上清液于1.5 mL 離心管中。然后在12% 聚丙烯酰胺凝膠中點(diǎn)樣，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，利用半干轉(zhuǎn)印儀（恒壓40 V，2 h）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，經(jīng)TBST洗膜，常溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶1 000 稀釋的Leptin 多克隆抗體4 ℃孵育2 h，充分洗滌后，再用1∶2 000 稀釋的羊抗兔IgG 室溫孵育1 h，洗滌3 遍，加入顯色試劑3 min，暗室曝光、顯影。同時(shí)設(shè)內(nèi)參β-actin作為對(duì)照。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)

雌性昆明小鼠（購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）65～70日齡18只，隨機(jī)分為3組（6只/組）：對(duì)照組，自由采食，試驗(yàn)當(dāng)天從尾靜脈注射100 μL生理鹽水；處理組，自由采食，試驗(yàn)當(dāng)天從尾靜脈注射重組質(zhì)粒與生理鹽水混合物100 μL（重組質(zhì)粒1 μg/只）；禁食組，連續(xù)禁食3 d，試驗(yàn)當(dāng)天從尾靜脈注射100 μL 生理鹽水。試驗(yàn)過(guò)程中所有分組小鼠均可自由飲水，在試驗(yàn)第3天稱(chēng)其體質(zhì)量，并采取斷頭采血的方法處死。

1.8 ELISA法檢測(cè)血清Leptin含量

各個(gè)分組小鼠血清Leptin水平用競(jìng)爭(zhēng)性抑制法ELISA 測(cè)定。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用GraphPad Prism 9.0軟件作圖并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒EGFP-leptin的構(gòu)建

leptin基因PCR 產(chǎn)物和pEGFP-N1 載體分別經(jīng)過(guò)Hind Ⅲ、BamH Ⅰ雙酶切，并進(jìn)行膠回收純化，得到約500 bp 和4.7 kb 的目的片段（圖1A 和1B），再用T4 連接酶連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。擴(kuò)菌16 h 后，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符（圖1C）。最后將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為EGFP-leptin。

圖1 重組質(zhì)粒EGFP-leptin的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid EGFP-leptin

2.2 EGFP-leptin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及陽(yáng)性克隆篩選

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后在熒光（490 nm）顯微鏡下觀(guān)察，如圖2A所示，有少量綠色熒光出現(xiàn)，48 h再次觀(guān)察，綠色熒光達(dá)到15%～20%（圖2B），對(duì)照組（圖2E）一直未發(fā)現(xiàn)有綠色熒光。在轉(zhuǎn)染10 d 時(shí)觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)1個(gè)綠色細(xì)胞克隆斑（圖2C），繼續(xù)用G418篩選20 d時(shí)，觀(guān)察到亮度增強(qiáng)的細(xì)胞克隆斑（圖2D）。用胰酶消化陽(yáng)性克隆斑，再進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.3 EGFP-Leptin 融合蛋白的RT-PCR 與Western blot檢測(cè)

為進(jìn)一步確定leptin是否在NIH/3T3 細(xì)胞中表達(dá)，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果（圖3A）顯示轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)約500 bp 的單一條帶，對(duì)照組未出現(xiàn)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株裂解后，提取其總蛋白質(zhì)，利用Leptin 抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體檢測(cè)EGFP-Leptin 融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組樣品出現(xiàn)約47 ku 清晰特異性條帶（圖3B），與預(yù)期EGFP-Leptin 融合蛋白大小一致，而陰性對(duì)照（圖3B）組未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組均有β-actin表達(dá)。說(shuō)明leptin基因在NIH/3T3細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖3 EGFP-Leptin融合蛋白表達(dá)鑒定Fig.3 Identification of fusion protein EGFP-Leptin

2.4 融合蛋白EGFP-Leptin的生物學(xué)特性檢測(cè)

由圖4A 可以看出，對(duì)照組、處理組和禁食組小鼠體質(zhì)量平均變化率分別為0.016%、-0.33%和-0.29%，處理組和禁食組小鼠體質(zhì)量變化率與對(duì)照組差異均顯著（P<0.05）。由圖4B 可知，對(duì)照組、處理組和禁食組小鼠血清Leptin 含量分別為11.05 μg/L、15.12 μg/L 和11.55 μg/L，處理組與禁食組小鼠血清Leptin 水平差異不顯著，但與對(duì)照組相比顯著升高，說(shuō)明EGFP-Leptin 融合蛋白在小鼠體內(nèi)活性很強(qiáng)，發(fā)揮了重要調(diào)控作用。

圖4 融合蛋白EGFP-Leptin的生物學(xué)特性Fig.4 Biological characteristics of fusion protein EGFP-Leptin

3 結(jié)論與討論

MERCATI 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Leptin 由167 個(gè)氨基酸組成，N 末端包含21 個(gè)氨基酸組成的分泌信號(hào)序列，與水牛Leptin 結(jié)構(gòu)相似。leptin基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯主要發(fā)生在脂肪組織，其他組織也發(fā)現(xiàn)有表達(dá)如胃、骨骼肌、腦垂體、乳房組織、胎盤(pán)和皮膚[15?16]等。在動(dòng)物血液循環(huán)中Leptin移位去除信號(hào)肽形成短鏈，以自由流通方式或以捆綁蛋白質(zhì)的形式出現(xiàn)，這些特點(diǎn)主要由種屬特異性或生理狀況的不同產(chǎn)生[16?17]。

利用雞的生物反應(yīng)器可使人leptin基因在NIH/3T3 細(xì)胞成功表達(dá)[17]；ZHANG 等[18]構(gòu)建的小鼠GFP-leptin重組質(zhì)粒在小鼠脂肪細(xì)胞中也得到成功表達(dá)。龐礴等[19]構(gòu)建高原鼠兔leptin特異表達(dá)載體pBC1-lep，利用質(zhì)粒脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞并篩選，僅有5%的轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)有l(wèi)eptin基因的表達(dá)，但未見(jiàn)篩選出穩(wěn)定表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞。周朋君等[20]構(gòu)建leptin基因原核表達(dá)載體pET-28a-leptin，在E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。本研究將水牛leptin基因插入到pEGFP-N1 中，構(gòu)建真核表達(dá)載體EGFP-leptin，將其轉(zhuǎn)染NIH/3T3 細(xì)胞得到成功表達(dá)，并且經(jīng)過(guò)G418藥物的篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)leptin基因的細(xì)胞株。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞匯合度在50%～70%時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率要優(yōu)于80%～90%的轉(zhuǎn)染效率。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)去內(nèi)毒素純化，質(zhì)量濃度為1.124 g/L，轉(zhuǎn)染24～48 h 內(nèi)，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度（根據(jù)熒光強(qiáng)弱判斷）逐漸增加。經(jīng)G418 篩選10 d 左右發(fā)現(xiàn)第1個(gè)細(xì)胞克隆斑，針對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行傳代篩選，最終獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

本研究采用RT-PCR 的方法對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的NIH/3T3 細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)構(gòu)建的載體EGFPleptin轉(zhuǎn)染NIH/3T3 細(xì)胞，有外源基因的表達(dá)。進(jìn)一步Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有單一特異條帶，從分子水平上證實(shí)了水牛leptin基因在NIH/3T3 細(xì)胞中成功表達(dá)。隨后把穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株又連續(xù)培養(yǎng)傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，說(shuō)明了重組質(zhì)粒EGFPleptin可以在異種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

基因的生物學(xué)活性單元作為研究生命科學(xué)的敏感元件，常常用細(xì)胞或分子水平活性測(cè)試的方式進(jìn)行。流體動(dòng)力學(xué)的開(kāi)發(fā)，使得外源基因能夠直接在動(dòng)物體內(nèi)有效表達(dá)[21]。LIU 等[22]利用熒光素酶和β-半乳糖苷酶的cDNA 作為報(bào)告基因，證明了通過(guò)尾靜脈快速注射大量DNA 溶液可以實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)。ARAD 等[22]從小鼠尾靜脈注射SV40 載體，可高效傳遞外源基因到肝臟，導(dǎo)致肝細(xì)胞長(zhǎng)期有轉(zhuǎn)基因表達(dá)。本研究中，將重組質(zhì)粒EGFP-leptin注射小鼠尾靜脈中，在第3天發(fā)現(xiàn)，注射組和禁食組小鼠質(zhì)量下降很快，與正常飼養(yǎng)的對(duì)照組小鼠差異顯著，與SCHNEIDER[8]的研究結(jié)果一致。在正常狀況下，機(jī)體內(nèi)脂肪的含量與血液中Leptin 水平維持相對(duì)的平衡，當(dāng)脂肪不斷消耗的同時(shí)，大量的Leptin 就會(huì)釋放出來(lái)[23]。重組質(zhì)粒在體內(nèi)高效表達(dá)，小鼠體質(zhì)量下降的同時(shí)，處理組小鼠血清Leptin水平迅速升高，與對(duì)照組差異顯著，而禁食組雖然小鼠質(zhì)量也下降很多，但血清Leptin 水平與對(duì)照組差異不顯著，顯然重組質(zhì)粒的高效表達(dá)起了關(guān)鍵作用。

綜上，本研究構(gòu)建的重組質(zhì)粒EGFP-leptin能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)，且表達(dá)的融合蛋白具有良好的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究水牛品質(zhì)改良或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。