牛 璐，邵 國， 孟憲梅，年媛媛

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

胃食管反流病(GERD)是一種常見并且多發(fā)的消化道疾病，并作為Barrett食管(BE)和食道腺癌(EAC)的重要危險因素。通常認(rèn)為GERD-BE-EAC的發(fā)生與發(fā)展是環(huán)境因素與遺傳相互作用的結(jié)果。隨著對胃食管反流及相關(guān)疾病研究的不斷深入，表觀遺傳學(xué)在胃食管反流病發(fā)生發(fā)展中的重要作用逐漸被認(rèn)識，與之相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制主要有甲基化和非編碼RNA的調(diào)控。本綜述討論了有關(guān)GERD與BE和EAC之間可能的表觀遺傳重疊，這可能對探究胃食管反流病的發(fā)病原因和食管腺癌的早期防控有重要意義。

1 GERD-BE-EAC的發(fā)生和發(fā)展

胃食管反流病(GERD)是由環(huán)境和遺傳因素共同作用的復(fù)雜疾病，主要癥狀是胃灼熱和反酸，并且通常先于Barrett食管(BE)和食道腺癌(EAC)的發(fā)展。流行病學(xué)研究表明全球GERD患病率呈上升趨勢，而EAC作為食管癌的主要類型之一，近年來發(fā)病率增高且生存率很低[1]。有學(xué)者使用LD評分回歸方法估計(jì)GERD和BE之間的遺傳相關(guān)性為77 %，GERD和EAC之間的遺傳相關(guān)性為88 %。這項(xiàng)研究為GERD的多基因基礎(chǔ)提供了第一個證據(jù)，并支持GERD和BE以及GERD和EAC之間的多基因重疊[2]。由于食管腺癌患者的發(fā)病率逐年上升且預(yù)后較差，對食管腺癌的早期病變Barrett食管和危險因素胃食管反流的研究對食管腺癌患者進(jìn)行早期診斷和防治有重要意義。

BE是EAC的主要癌前病變，每年有0.12 %至0.5 %的BE患者發(fā)展為EAC[3]，而BE通常是在慢性胃食管反流(GERD)的背景下出現(xiàn)的。多項(xiàng)研究描述了與EAC相關(guān)的風(fēng)險因素，大約80 %的EAC病例與吸煙史，胃食管反流病，中心性肥胖，低蔬菜水果飲食有關(guān)[4]。臨床上，GERD除了表現(xiàn)出胃灼熱和回流的癥狀也經(jīng)常以非典型方式出現(xiàn)食管外癥狀，如胸痛、牙齒侵蝕、慢性咳嗽、喉炎或哮喘，嚴(yán)重影響患者的心理健康和日常生活。然而，目前還沒有非常明確的原因來解釋GERD的發(fā)展。

多年來，已發(fā)現(xiàn)GERD的發(fā)病機(jī)制中涉及若干環(huán)境因素。在胃食管反流病及其相關(guān)疾病中，存在化生-異型增生-癌的變化，上皮細(xì)胞內(nèi)存在體細(xì)胞遺傳和表觀遺傳變化的累積，這可能是決定癌癥進(jìn)展可能性的一個重要因素。表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是一個新興的研究領(lǐng)域，用于描述基因在不改變序列的情況下是如何與環(huán)境相互作用而產(chǎn)生特定表型，是可逆的并且可遺傳的基因表達(dá)的變化。其主要內(nèi)容包括DNA甲基化，非編碼RNA調(diào)控和組蛋白修飾，染色質(zhì)重塑等。而表觀遺傳修飾連接著環(huán)境因素與基因表達(dá)，提示其可能在GERD-BE-EAC中扮演重要角色。

2 與GERD-BE-EAC相關(guān)的表觀遺傳基因

2.1非編碼RNA(ncRNA) 人類基因組大約70 %被轉(zhuǎn)錄為RNA, 而只有不到2 %編碼蛋白質(zhì)[5-7]。隨著人們對人類基因組了解的增加，越來越多的證據(jù)表明基因組中的非編碼部分在人類的正常生理和疾病中都有著不可或缺的作用[8-9]。在胃食管反流病-Barrett食管-腺癌過程中，ncRNA起到了重要作用。

2.1.1lncRNA lncRNA是一類不編碼功能性蛋白的內(nèi)源性RNA，其定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。lncRNA通常具有高度組織或細(xì)胞特異性，有可能成為腫瘤診斷的新型生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。Bartolomei于1991年發(fā)現(xiàn)了第一個長的非編碼RNA(lncRNA)H19[10]。Okazaki等人在2002年，首次將lncRNA明確定義為長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本[11]。近年來，lncRNAs被證明在表觀遺傳調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中扮演重要角色[12-13]，尤其在癌癥中[14-15]。

AFAP1-AS1是人類癌癥中的新型致癌性長非編碼RNA，最初于2013年在食道腺癌中發(fā)現(xiàn)。AFAP1-AS1是在AFAP1編碼基因位點(diǎn)反義鏈轉(zhuǎn)錄的上調(diào)的lncRNA，Wu等[16]報道AFAP1-AS1在Barrett食管、食管腺癌組織和食管腺癌組織細(xì)胞系中過度低甲基化和過表達(dá)，在BE和EAC中表現(xiàn)出明顯的低甲基化，同時敲低它并不會明顯改變EAC細(xì)胞中AFAP1的表達(dá)，但會通過誘導(dǎo)G2/M期停滯以及細(xì)胞生長和侵襲減少而導(dǎo)致增殖的減少，提示某些lncRNA可能通過表觀遺傳調(diào)控促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展而不是通過對鄰近mRNA進(jìn)行調(diào)控。推測AFAP1-AS1是在食道細(xì)胞中發(fā)揮功能性癌前作用的分子，它的過表達(dá)與低甲基化有關(guān)。

此外，已經(jīng)證明了一些相關(guān)基因或信號通路參與了AFAP1-AS1的致癌功能，例如EMT相關(guān)基因和小的GTPase信號傳導(dǎo)Rho/Rac通路，但其特定的上游和下游分子機(jī)制需要未來進(jìn)一步的分析。功能實(shí)驗(yàn)表明，AFAP1-AS1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲并抑制細(xì)胞凋亡。

在許多情況下，lncRNA通過調(diào)節(jié)鄰近的編碼基因的表達(dá)而起作用，但是仍然有例外。Yang等[17]證實(shí)了HNF1A-AS1在EAC組織和細(xì)胞系中異常上調(diào)，并可能在惡性腫瘤的發(fā)展中表現(xiàn)出輔助作用。敲低HNF1A-AS1不會顯著改變HNF1A mRNA的表達(dá)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)HNF1A-AS1抑制，下游癌癥相關(guān)的lncRNA H19的表達(dá)會明顯降低。

另一個廣受關(guān)注的lncRNA基因PVT1已成為多種腫瘤中的癌基因，實(shí)驗(yàn)表明與配對的Barrett食管組織和正常食管組織相比，食管腺癌組織中PVT1表達(dá)上調(diào)。PVT1的高表達(dá)與分化不良、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期縮短有關(guān)。使用PVT1 反義寡核苷酸(ASOs)有效地敲除EAC細(xì)胞中的PVT1可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、侵襲、集落形成、腫瘤球體形成和ALDH1A1+細(xì)胞比例降低。在機(jī)制上，EAC細(xì)胞中PVT1和YAP1相互調(diào)節(jié)。YAP1對PVT1有正調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利用其特異性ASOs靶向PVT1和YAP1可在體內(nèi)外產(chǎn)生更好的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，PVT1賦予食管腺癌一種侵襲性表型，并且是一種不良的預(yù)后指標(biāo)。PVT1和YAP1聯(lián)合靶向提供了最高的治療指數(shù)，代表了一種新的治療策略[18]。

但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)與AFAP1-AS1相關(guān)的miRNAs，并且關(guān)于癌癥患者和健康人血液中的精確濃度和檢測方法并不十分明確，這阻礙了lncRNA的臨床應(yīng)用。有關(guān)lncRNA的研究仍然處在一個早期階段,其與蛋白、miRNAs、mRNAs、ceRNAs和其他lncRNA的關(guān)系值得進(jìn)一步地探究和理解。

2.1.2microRNA MicroRNA(miRNA)是小(18～25個核苷酸)RNA，具有非蛋白質(zhì)編碼能力，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[19]。miRNAs對人類約三分之一的基因起調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)模式的異?？梢砸餑ERD及其相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。miRNA通過刺激靶向信使RNA(mRNA)降解和抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮其調(diào)控作用。在多種疾病中，尤其是在惡性腫瘤中，已檢測到miRNA的失調(diào)多項(xiàng)研究探索了BE和EAC中miRNA表達(dá)水平的變化[20-21]。

miRNA可通過與抑癌基因和轉(zhuǎn)移抑制基因的結(jié)合促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)MiR-21靶向抗癌基因和轉(zhuǎn)移抑制基因，例如程序性細(xì)胞死亡4(PDCD4)、腫瘤抑制基因原肌球蛋白1(TPM1)、磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)等，從而證明了其參與了癌癥生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。 重要的是，與鱗狀食道上皮相比，BE和EAC中的miR-21表達(dá)上調(diào)。與癌旁組織相比，癌性EAC中miR-21過度表達(dá)(HR = 4.2， 95 %CI = 1.68-10.61)，表明它可能與多種組織學(xué)類型的食管腫瘤有關(guān)。但尚不清楚miR-21是通過外泌體途徑從癌細(xì)胞中主動分泌還是通過細(xì)胞凋亡連續(xù)釋放入循環(huán)。Maru等報道了EAC中miR-196a的表達(dá)增加和不典型增生。miR-196a的假定靶標(biāo)包括HMGA家族成員和HOX基因(HOXD8，HOX C8，HOXA7和HOXB8)[23]。Luthra等發(fā)現(xiàn)針對膜聯(lián)蛋白A1(ANXA1)的miR-196a在EAC組織中被上調(diào)，MiR-196a抑制ANXA1的表達(dá)，隨后發(fā)揮抗凋亡作用并有助于EAC細(xì)胞存活。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-196a是BE腫瘤發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物，并證明了BE-EAC轉(zhuǎn)化過程中miR196a表達(dá)的逐步上調(diào)[24]。Maru等也發(fā)現(xiàn)miR-196a在EAC和BE中表達(dá)高于正常鱗狀黏膜，并顯示出抗凋亡和促進(jìn)生長的功能。作者進(jìn)一步證實(shí)，miR-196a通過基于miR-196a的模擬和熒光素酶報告基因檢測可特異性靶向S100A9 3’UTR，SPRR2C和KRT5。因此miR-196a水平可能成為早期食管腺癌檢測中的重要工具[25]。進(jìn)一步確認(rèn)miRNA的靶向基因?qū)τ诹私庠搈iRNA的詳細(xì)生物學(xué)功能并確定其在EAC發(fā)展中的作用十分重要。

2.2甲基化 DNA甲基化是一種在胞嘧啶的CpG位點(diǎn)的碳-5位上加一個甲基的現(xiàn)象，CpG位點(diǎn)由一個胞嘧啶與鳥嘌呤相鄰組成。這種表觀遺傳學(xué)改變被認(rèn)為影響基因表達(dá)，因此可能是腫瘤發(fā)生的一個因素。在Barrett細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了許多抑癌基因、DNA修復(fù)和黏附分子基因的異常甲基化，如AKAP12、22、APC23 24和GPX3[26-27]。在它的發(fā)生過程中，還觀察到抑癌基因(p16、APC、RUNX3、HPP1、TIMP3等)的啟動子甲基化[28]。這樣的研究已經(jīng)闡明，啟動子超甲基化通常是GERD-Barrett-EAC序列中的一種早期和進(jìn)行性的異常表現(xiàn),表明這些基因的差異甲基化有一定意義。與正常食管黏膜相比，BE和EAC都經(jīng)常高度甲基化，盡管其水平是異質(zhì)的。例如，CDKN2A啟動子(p16INK4a)的超甲基化很常見，并與BE的腫瘤進(jìn)展有關(guān)，并伴有9p21丟失，導(dǎo)致CDK2NA失活，這是有創(chuàng)EAC中的常見發(fā)現(xiàn)[26-27, 29]。Wu等[16]評估了BE和EAC中全基因組的低甲基化，盡管CpG的密度高，但低甲基化被證明是BE的主要表觀遺傳變化。另外,非編碼區(qū)域中的變化比編碼區(qū)域中的變化大。此外，較大的非編碼區(qū)顯示更多差異甲基化。有研究通過甲基化陣列分析了進(jìn)行性增生與非進(jìn)行性增生的Barrett食管患者組織，鑒定出了44種甲基化標(biāo)記，它們可以區(qū)分發(fā)展為腺癌或保持靜止?fàn)顟B(tài)的非增生性Barrett食管。并且對最近鑒定的腫瘤抑制因子OR3A4(探針cg09890332)的低甲基化已在一個單獨(dú)的樣本組中進(jìn)行了驗(yàn)證， 發(fā)現(xiàn)兩組之間的拷貝數(shù)沒有差異，但是在進(jìn)展組中觀察到了偏向低甲基化的總體趨勢。因此OR3A4的低甲基化可以對非增生性Barrett食管患者進(jìn)行危險分層，并可能構(gòu)成未來監(jiān)測計(jì)劃的基礎(chǔ)[30]。

3 展望

隨著GERD變得越來越普遍，以及癌癥風(fēng)險的增加，傳統(tǒng)上BE患者定期接受內(nèi)鏡檢查，如果沒有其他異常發(fā)現(xiàn)，通常每2至3年進(jìn)行一次。因此，患者一生中通常要接受多達(dá)10次或更多次的內(nèi)窺鏡檢查，這就需要在GERD的管理中采用更加量身定制的方法。不同類型的表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制通常并不單獨(dú)在疾病中起作用，它們之間也存在協(xié)同作用。從表觀遺傳學(xué)的角度對疾病的發(fā)病原因進(jìn)行探究，以在對患者的管理中進(jìn)行危險分層，及時進(jìn)行更加有針對性的干預(yù)措施。這將更有益于對GERD的病因的理解及GERD相關(guān)癌癥的早期預(yù)防和治療。