王秀琴，張春曉，魯康樂，王 玲，宋 凱

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

花鱸(Lateolabraxmaculatus)，別名海鱸、七星鱸。因其具有適應(yīng)性廣、肉鮮味美、營養(yǎng)豐富與生長快速等優(yōu)質(zhì)特性，深受養(yǎng)殖戶喜愛，年產(chǎn)量逐年增長，2018年其養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)16.66萬噸[1]，成為僅次于大黃魚的第二大海水養(yǎng)殖魚類。然而，高密度的養(yǎng)殖模式以及化學(xué)藥劑的濫用會引起魚類機(jī)體的氧化應(yīng)激，進(jìn)而破壞肝功能，導(dǎo)致肝臟損傷，影響魚類正常生長[2-5]。因此有必要防止氧化應(yīng)激對魚類造成的影響?；诖耍┠昕蒲泄ぷ髡咧铝τ陂_發(fā)一種“綠色、高效、低成本”的保肝型綠色添加劑來應(yīng)對氧化應(yīng)激。中草藥具有低成本、污染少、毒副作用小等優(yōu)點，其主要發(fā)揮作用的成分如多糖、類黃酮和皂苷類能減少氧化應(yīng)激，保護(hù)肝臟[6]。在我國，使用中草藥預(yù)防和治療魚類疾病已十分普遍[7-8]。因此，本實驗以原代培養(yǎng)花鱸肝細(xì)胞為實驗材料，擬從具有保肝功能的10種單方和10種復(fù)方中[9]篩選出能有效緩解原代培養(yǎng)花鱸肝細(xì)胞氧化損傷的中草藥，為中草藥在花鱸養(yǎng)殖業(yè)更廣泛的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花鱸購于福建省漳州市詔安縣慧豐水產(chǎn)發(fā)展有限公司。將實驗魚放置在1×103L的循環(huán)桶中暫養(yǎng)，每天飽食投喂一次(9:00)，并換50%體積的淡水，水溫維持在27 ℃左右，溶解氧大于7.5 mg/L，pH 5.9～6.8。實驗魚適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周后，每次實驗前挑選體格健壯、規(guī)格一致的花鱸(體重(30±5.0)g，體長(10±0.9)cm)，放入盛有體積分?jǐn)?shù)為0.1%的青霉素與鏈霉素的水里暫養(yǎng)并禁食12 h。

1.2 主要試劑

于廈門集美印斗路蓮福堂大藥房購買實驗所需的中草藥。

胰蛋白酶(體積分?jǐn)?shù)0.25%)、L-15培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司?？偟鞍锥?BCA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、10 000 IU/mL青霉素(S)和10 000 IU/mL鏈霉素(P)購自北京索萊寶科技有限公司。過氧化氫(含過氧化氫30%)、紅細(xì)胞裂解液、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)購自南京建成生物工程研究所。

完全培養(yǎng)基：L-15培養(yǎng)基(含有1%S/P，15%FBS(體積分?jǐn)?shù)))。

1.3 花鱸原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)

花鱸原代肝細(xì)胞培養(yǎng)方法參照李磊等[10]的報道。

1.4 中草藥的制備

將10味單方中草藥(甘草、銀杏、柴胡、丹參、蒼穹、赤芍、五味子、大黃、姜黃和豬苓)直接粉碎，10味復(fù)方中草藥(主要成分見表1)按照一定比例粉碎混合，各方稱取20 g倒入盛有150 mL 純水的玻璃杯中，浸泡1 h后，開始煎煮，溫度保持在90 ℃，邊煮邊攪拌。待煮0.5 h后過濾，收集濾液，重復(fù)煎煮并收集濾液3次。合并3次濾液，濃縮定量至20 mL，使各方中草藥質(zhì)量濃度為1 g/mL，經(jīng)離心滅菌處理后，暫存于4 ℃冰箱。

1.5 中草藥安全性評價

將原代培養(yǎng)的花鱸肝細(xì)胞平鋪于96孔板中，培養(yǎng)24 h貼壁后，再分別加入20味中草藥(質(zhì)量濃度為5 mg/mL)孵育4 h，然后使用CCK-8檢測肝細(xì)胞的存活率。實驗重復(fù)5次。

表1 復(fù)方中草藥部分組成成分表

1.6 實驗分組設(shè)計

H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷的方法參照張潤蔚[11]的實驗并稍作修改，按其方法獲得的適宜損傷條件為：H2O2濃度為200 μmol/L，作用時間為2 h。花鱸肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將其分為對照組、損傷組、藥物組。對照組換用新的完全培養(yǎng)基孵育肝細(xì)胞6 h后收集培養(yǎng)液與肝細(xì)胞；損傷組先用完全培養(yǎng)基孵育肝細(xì)胞4 h后，再換用200 μmol/L H2O2的新培養(yǎng)基孵育肝細(xì)胞2 h，收集培養(yǎng)液與肝細(xì)胞；藥物組用含質(zhì)量濃度為5 mg/mL的中草藥完全培養(yǎng)基孵育肝細(xì)胞4 h，再換用200 μmol/L H2O2繼續(xù)孵育肝細(xì)胞2 h后收集培養(yǎng)液與肝細(xì)胞。

1.7 生化指標(biāo)的測定

生化指標(biāo)測定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所用實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后用SPSS 20.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-Way ANOVA)，多重比較方法選用Tukey法，以P<0.05表示差異顯著，實驗數(shù)據(jù)最終以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥對花鱸肝細(xì)胞活力的影響

由圖1～2可知：與對照組相比，10種單方和10組復(fù)方中草藥對花鱸肝細(xì)胞的存活率無顯著影響(P>0.05)。所以，本實驗所用的20組中草藥均對花鱸原代肝細(xì)胞無毒副作用。

2.2 各組AST、ALT和LDH活性的變化

由表2可知：損傷組培養(yǎng)液中AST、ALT和LDH較對照組顯著升高(P<0.05)，除大黃組以外的其他單方組的AST、ALT和LDH活性較損傷組顯著降低(P<0.05)；姜黃、甘草和五味子單方組的AST活性較其他單方組顯著降低(P<0.05)；姜黃、丹參和五味子單方組的ALT活性較其他單方組低(P<0.05)；姜黃單方組的LDH活性水平較其他單方組低(P<0.05)。綜上，除大黃以外的其他9種單方均能保護(hù)肝細(xì)胞氧化損傷，其中姜黃組的保護(hù)效果最佳。

由表2還可知：H2O2損傷組，AST和ALT活性顯著高于對照組(P<0.05)；LDH活性有上升趨勢，但無顯著影響(P>0.05)。M5組的LDH較損傷組無顯著差異(P>0.05)；10種復(fù)方組的AST和ALT活性與損傷組比顯著降低(P<0.05)；M9組的AST、ALT和LDH活性較其他各復(fù)方組低(P<0.05)，其AST和ALT的活性與對照組無差異(P>0.05)。綜上，除M5組以外的其他9組復(fù)方中草藥均能緩解肝細(xì)胞氧化損傷，以M9復(fù)方保護(hù)效果最佳。

表2 各組花鱸肝細(xì)胞AST、ALT和LDH活性

2.3 各組T-AOC、SOD和MDA水平的變化

如表3所示，在H2O2處理肝細(xì)胞2 h后，損傷組的T-AOC和SOD活性較對照組顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05);姜黃、甘草、大黃、丹參和銀杏單方組的T-AOC活性較損傷組顯著升高(P<0.05);10味單方組的SOD活性較損傷組均顯著升高(P<0.05)；柴胡和蒼穹單方組肝細(xì)胞中MDA含量與損傷組相比沒有顯著差異(P>0.05),姜黃單方組肝細(xì)胞中T-AOC和SOD活性則高于損傷組。綜合以上結(jié)果，在本實驗條件下，與其他單方組相比，姜黃單方組對氧化損傷的花鱸肝細(xì)胞的保護(hù)效果最好。

由表3可知，M10組的T-AOC活性與損傷組相比無顯著差異(P>0.05)，M7和M10組的SOD活性與損傷組相比無顯著差異(P>0.05)，M2、M3、M8和M10組的MDA含量與損傷組相比無顯著變化(P>0.05)；M1、M4、M5、M6、M9組的T-AOC和SOD活性顯著高于損傷組(P<0.05)，MDA含量顯著低于損傷組(P<0.05)。M9組T-AOC和SOD活性高于其他各復(fù)方組，而MDA含量低于其他各復(fù)方組，即M9組對H2O2誘導(dǎo)的花鱸肝細(xì)胞氧化抗損傷作用最強(qiáng)。

表3 各組花鱸肝細(xì)胞T-AOC、SOD和MDA的含量

3 討論

H2O2是一種作用很強(qiáng)的氧化劑，其通過氧化細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜組分發(fā)生異常，胞內(nèi)AST、ALT釋放到體液中，引起細(xì)胞或組織氧化損傷[11-15]。本實驗中，用H2O2直接處理肝細(xì)胞后其培養(yǎng)液中AST、ALT和LDH的活性水平上升，說明肝細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。而在H2O2處理前使用中草藥加以保護(hù)，AST、ALT和LDH的活性均降低，這說明中草藥能緩解H2O2引起的肝細(xì)胞氧化損傷。姜黃和五味子單方組的AST、ALT和LDH的含量低于其他組，說明這兩味中草藥能顯著提高肝細(xì)胞的抗氧化能力。有研究表明，中草藥中含有的多糖類、類黃酮和皂苷類，能保護(hù)肝臟免受氧化損傷[16]，姜黃含有豐富的酚類化合物，可減少細(xì)胞內(nèi)ROS生成[17-19]。王麗宏等[20]的研究表明五味子的有效成份木脂素類，通過降低轉(zhuǎn)氨酶活性，維持肝臟的正常生理狀態(tài)。綜上，姜黃和五味子中的有效成分具有清除自由基、降低轉(zhuǎn)氨酶活性和提高機(jī)體抗氧化的能力。

有研究[21]表明，有些中草藥配伍，能更大程度地發(fā)揮作用。本實驗中M9組顯著降低AST、ALT和LDH的活性，可能是因為此復(fù)方中的中藥具有協(xié)同保護(hù)肝臟的作用。赤芍因其含有豐富的單萜苷類化合物，可以通過抑制ROS的產(chǎn)生，提高抗氧化能力[22]，與金錢草配伍，可以降低肝臟中轉(zhuǎn)氨酶的活性，清除自由基，保護(hù)肝臟免受損傷[23]。

T-AOC反映機(jī)體總抗氧化的能力。本研究中，損傷組T-AOC的活性較對照組低，表明肝細(xì)胞抗氧化能力下降。姜黃單方組和M9組T-AOC的活性明顯高于其他各組，說明這兩方中草藥提高了肝細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)肝細(xì)胞免受H2O2的不利影響，維持肝臟的健康。MDA是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，是判斷細(xì)胞或組織發(fā)生氧化反應(yīng)的重要指標(biāo)之一[24]。SOD通過清除細(xì)胞或組織內(nèi)的自由基來保護(hù)機(jī)體免受損傷，其活性的大小反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[25]。姜黃組和M9組SOD的活性較損傷組顯著升高，同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量顯著下降，這說明這兩方中草藥肝細(xì)胞清除自由基能力變強(qiáng)，可以減少H2O2引起的氧化損傷。有研究[26]表明，姜黃素可以通過升高T-AOC和SOD活性水平,減少M(fèi)DA生成，來對抗氧化應(yīng)激，這與本實驗結(jié)果一致。孫學(xué)亮等[21]的研究表明，由大黃、丹皮和黃芪為主要成分組成的復(fù)方中草藥通過提高亞東鮭(Salmotruttafario)和白點鮭(SalvelinuspluviusHilgendorf)血液中SOD和T-AOC的活性，提高其抗氧化能力，是因為其之間的協(xié)同作用。由此可知，姜黃單方和M9復(fù)方對H2O2誘導(dǎo)的花鱸原代肝組織損傷的保護(hù)作用與其清除自由基能力有關(guān)。姜黃能保持細(xì)胞抗氧化指標(biāo)(T-AOC和SOD)的酶活性，使MDA的生成減少，增強(qiáng)抗氧化能力。

4 結(jié)論

在本研究的10味單方和10味復(fù)方中草藥中，丹參、銀杏、姜黃、甘草、赤芍、豬苓、五味子單方組，M1、M4、M6、M7、M9復(fù)方組均能緩解由H2O2誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)花鱸肝細(xì)胞損傷，提高肝細(xì)胞的抗氧化能力；大黃、柴胡、蒼穹單方組，M2、M3、M5、M8、M10復(fù)方組的抗氧化能力較其他組弱。從20組中草藥中篩選出姜黃單方和M9復(fù)方對肝臟保護(hù)效果最好。