諶苗苗 姜曉旭 鐘 亮 焦 陽 徐 亮

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城 118100)

柞蠶(Antheraeapernyi)屬鱗翅目大蠶蛾科昆蟲，起源于中國，在我國有著2000多年的放養(yǎng)歷史，“柞林青葉壯蠶魄，山繭素綢平世窮”是中國柞蠶業(yè)內(nèi)容與功能的形象寫照[1]。柞蠶業(yè)是我國的一項(xiàng)傳統(tǒng)特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，隨著柞蠶全基因組測序的完成，我國柞蠶基礎(chǔ)性研究也進(jìn)入了一個新的發(fā)展階段，其關(guān)鍵性研究工作是對海量基因組序列信息的分析以及重要功能基因的解析，并且將遺傳信息和柞蠶表型或性狀相關(guān)聯(lián)，從而為今后的種質(zhì)資源遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

在分子生物學(xué)研究中，雖然可通過經(jīng)典遺傳學(xué)方法構(gòu)建遺傳群體，利用定位克隆法獲得功能基因的信息[2]，但柞蠶存在生長周期長，且需在野外放養(yǎng)，管理困難等問題，難以滿足相關(guān)研究的開展條件。目前，研究基因功能主要涉及兩種方法：一是通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因、RNA干擾、過表達(dá)等方法使目的基因在細(xì)胞或個體中產(chǎn)生基因表達(dá)水平的量變，觀察細(xì)胞或個體的反應(yīng)及變化來研究目的基因的功能[3]；二是通過基因編輯方法將目的基因在基因組中敲入、敲除或者是使其完全喪失功能，造成基因表達(dá)產(chǎn)物有無的質(zhì)變，觀察細(xì)胞或個體的反應(yīng)及表型變化，以鑒定目的基因的功能[4]。近年來發(fā)展起來的基于核酸內(nèi)切酶的基因靶向編輯技術(shù)，已成為基因功能研究的主流，并逐漸在生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究、人類疾病預(yù)防與治療以及經(jīng)濟(jì)物種遺傳改良等領(lǐng)域突顯其重要作用[5]。

1 基因編輯技術(shù)原理簡述

基因編輯也稱基因組編輯或基因組工程，是指對基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行刪除、替換、插入等定向改造，獲得預(yù)期的生物體基因組序列發(fā)生遺傳性改變的技術(shù)。最早應(yīng)用的基因組編輯技術(shù)是基于DNA雙鏈斷口(double strands breaks, DSBs)同源重組(homologous recombination, HR)的基因打靶。該技術(shù)需采用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES cell)進(jìn)行同源重組打靶，僅局限于有可嵌合遺傳ES細(xì)胞的動物，且基因組中會殘留外源性基因。其后發(fā)展了3種基于人工核酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease, EEN)的新型基因組靶向編輯技術(shù)，可依靠非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)或HR等DSB修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)對基因組靶位點(diǎn)的定點(diǎn)改造。該類技術(shù)通過受精卵注射可直接得到突變個體，在物種間具有更好的通用性，同時避免了外源基因殘留的問題，已被廣泛應(yīng)用于后基因組時代的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小鼠(Musmusculus)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、家蠶(Bombyxmori)等多種模式生物[6,7]。

1.1 鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)

第一代EEN基因靶向編輯技術(shù)——ZFN是由特異性識別DNA序列的鋅指蛋白(zinc finger protein, ZFP)結(jié)構(gòu)域和非特異性切割DNA雙鏈的核酸酶FokⅠ結(jié)構(gòu)域組成[8,9]。鋅指結(jié)構(gòu)域最初在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)中發(fā)現(xiàn)，一般由串聯(lián)3～6個Cys2-His2 型ZFP組成，每個ZFP可特異性識別一個三聯(lián)體的DNA堿基組合[10]。一對ZFN以相對方向分別結(jié)合DNA雙鏈，當(dāng)兩個Fok I結(jié)構(gòu)域在間隔合適長度(通常5～7 bp)的序列時，實(shí)現(xiàn)二聚化產(chǎn)生內(nèi)切酶活性切斷DNA雙鏈，然后主要借助NHE J等細(xì)胞內(nèi)源性DSB修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因定點(diǎn)編輯[11]。但是，至今尚未完全掌握ZFP同任意DNA靶序列之間的對應(yīng)關(guān)系，對一般研究者而言，獲得有效的ZFN仍是一個高成本的技術(shù)難題，因此也限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

1.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)

第二代EEN基因編輯技術(shù)——TALEN與ZFNs類似，也是由識別特異性DNA序列的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector, TALE)蛋白結(jié)構(gòu)域和FokⅠ結(jié)構(gòu)域兩部分組成[12-15]。TALE最初是在黃單胞桿菌(XanthomonasCampestris)中被發(fā)現(xiàn)，是由33～35個氨基酸組成，其第12和13位為重復(fù)可變雙殘基 (repeat variable diresidue, RVD)，用于特異性識別并結(jié)合單個DNA堿基，其余氨基酸則高度保守[16]。TALE結(jié)構(gòu)域主要由3部分組成，C端為含有核定位信號的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，中段為與DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，N端為轉(zhuǎn)運(yùn)信號結(jié)構(gòu)域。其中，DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般由1～33個TALE重復(fù)串聯(lián)而成，末尾加入長度20個氨基酸的0.5個TALE。與ZFN不同，TALE與核苷酸1對1識別并結(jié)合的機(jī)制相對簡單，已明確4種不同堿基A、T、C和G對應(yīng)的RVD分別為NI(Asn Ile)、NG(Asn Gly)、HD(His Asp)和 NN(Asn Asn)[7,17]。一對TALEN的識別序列也需要間隔適當(dāng)?shù)拈g距(13～30 bp)以保證FokⅠ的切割活性，一般將FokⅠ連接在TALE結(jié)構(gòu)域的C端可獲得更高的切割活性[18]。與ZFN相比，TALEN更便于設(shè)計(jì)，研究成本較低，已廣泛應(yīng)用于多種模式生物。

1.3 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)相關(guān)核酸酶Cas9(CRISPR/Cas9)系統(tǒng)

第三代EEN基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9是由Cas9蛋白和單導(dǎo)向RNA(single-guide RNA, sgRNA)組成，與ZFN、TALEN的原理不同，是基于堿基互補(bǔ)原則的靶標(biāo)序列互補(bǔ)RNA與靶標(biāo)序列DNA間的特異性結(jié)合[19,20]。CRISPR是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的獲得性免疫系統(tǒng)[21]，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為I—III三大類型[22]，其中源自化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。包含DNA靶位點(diǎn)的引導(dǎo)序列與CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被加工為CRISPR RNA(crRNA)，與trans-activating CRISPR RNA(tracrRNA)以部分區(qū)段堿基互補(bǔ)連接合成sgRNA，再與Cas9蛋白形成復(fù)合體，由crRNA中的特異性序列引至緊挨前體間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)的DNA靶位點(diǎn)，由引導(dǎo)序列(一般為20 bp)與靶位點(diǎn)DNA堿基互補(bǔ)結(jié)合并啟動Cas9核酸酶切割DNA雙鏈，由Cas9蛋白的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補(bǔ)鏈，而RuvC結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈[23]，之后依靠NHEJ等修復(fù)途徑來實(shí)現(xiàn)基因編輯。較之ZFN和TALEN這種蛋白質(zhì)與DNA之間的互作，CRISPR/Cas9的原理更加簡單、穩(wěn)定，sgRNA的設(shè)計(jì)更簡易，并且可通過一次打靶完成多基因的編輯。該技術(shù)問世以來，因其載體構(gòu)建簡單，脫靶率低，效率高，適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為基因組編輯的主流技術(shù)。

2 鱗翅目模式昆蟲——家蠶的基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用現(xiàn)狀

20世紀(jì)初，法國、日本及中國等學(xué)者先后利用家蠶驗(yàn)證了孟德爾遺傳定律，發(fā)現(xiàn)母性遺傳、連鎖遺傳及伴性遺傳規(guī)律，且在家蠶生理遺傳、形態(tài)遺傳研究領(lǐng)域取得不俗的成就，奠定了家蠶研究在遺傳學(xué)領(lǐng)域的先驅(qū)性[24]。直至近現(xiàn)代分子生物學(xué)時期，以基因工程和重組技術(shù)為主的眾多現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，推動果蠅、小鼠、線蟲、斑馬魚等發(fā)展為生物學(xué)研究的模式動物，而家蠶因其自身的局限性，尤其是同源重組率低、穩(wěn)定性差等因素，基礎(chǔ)研究發(fā)展相對滯后，逐漸失去的分子生物學(xué)領(lǐng)域的領(lǐng)先地位[25]。

2.1 家蠶基因靶向編輯技術(shù)的建立

2010年Fujii等[26,27]通過轉(zhuǎn)基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明家蠶基因組Z染色體上的BmBLOS2基因的缺失或敲除突變是od家蠶幼蟲呈現(xiàn)“油蠶”表型的根本原因。同年，Takasu等[28]利用ZFN首次實(shí)現(xiàn)對家蠶內(nèi)源基因的靶向編輯，在G1代獲得敲除BmBLOS2基因的純合突變家蠶個體。雖然該研究編輯效率不高(僅0.28%)，但對家蠶基因組靶向編輯研究的發(fā)展起到了里程碑式的作用，其后TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)在家蠶中的首次應(yīng)用，均采用突變體表型明顯、易于篩選的BmBLOS2基因作為靶標(biāo)基因[29]。此后的一些家蠶ZFN基因編輯研究均顯示ZFN在家蠶中的編輯效率低，設(shè)計(jì)高活性、高特異性的ZFN比較困難。2013年Wang等[30]和Takasu等[31]利用Golden Gate組裝體系建立了一套適用于家蠶的TALE組裝方法和基于胚胎的效率檢測體系。同年Wang等[32]通過顯微注射體外合成編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA，實(shí)現(xiàn)家蠶基因組編輯。2014年Liu等[33]構(gòu)建了基于質(zhì)粒DNA顯微注射的Cas9載體系統(tǒng)。自此，家蠶的TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)經(jīng)逐步完善，在后基因組時代極大地推動了家蠶基因功能解析及家蠶素材創(chuàng)新研究的發(fā)展。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)因具有原理清楚、設(shè)計(jì)方便、載體構(gòu)建簡單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為家蠶基因組編輯的主流技術(shù)。

2.2 家蠶基因組編輯的主要應(yīng)用類型

目前，家蠶基因組靶向編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于家蠶的未知內(nèi)源基因功能分析與鑒定[34]、絲腺生物反應(yīng)器開發(fā)[35,36]、繭絲合成與分泌機(jī)制[37]、性別調(diào)控[38]、抗性育種[39]等研究領(lǐng)域。其實(shí)現(xiàn)基因組操作的主要類型包括：家蠶內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變、基因組結(jié)構(gòu)變異、外源基因在家蠶基因組定點(diǎn)整合與敲除等。

2.2.1 家蠶內(nèi)源基因定點(diǎn)突變

該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)在靶位點(diǎn)造成缺失或插入等基因突變，以介導(dǎo)靶位點(diǎn)內(nèi)源基因的敲除，是目前生物內(nèi)源編碼基因功能研究最常規(guī)、最主要手段之一[40]，主要集中于家蠶內(nèi)源基因基因功能驗(yàn)證、基因功能分析、定向改造突變體三個方面。

基因功能驗(yàn)證是以利用定位克隆在自然突變體中鑒定到的相關(guān)基因?yàn)榘谢?，在野生型中利用基因編輯技術(shù)對靶基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，然后通過敲除后野生型與自然突變體表型變化對比分析來驗(yàn)證定位克隆的準(zhǔn)確性。如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對細(xì)胞色素沉淀相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因(apt-like)、鳥苷酸環(huán)化酶基因(BmGC-I)[41]、血紅素過氧化物酶編碼基因(Bm-cardinal)及棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ZDHHC18類似蛋白編碼基因(BmAPP)等進(jìn)行功能驗(yàn)證。

基因功能分析是以已鑒定功能基因的同源基因或通過信息分析獲得的未知內(nèi)源基因?yàn)榘谢?，利用基因組靶向編輯技術(shù)建立該靶基因定點(diǎn)敲除突變體，然后通過檢驗(yàn)敲除后突變個體表型、性狀等變化來分析靶基因的功能。如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對蛻皮激素氧化酶基因(BmEO)[42]，家蠶翅發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因BmWnt-1及miR-2家族靶基因Bmawd和Bmfng，家蠶氣味共受體基因(BmOrco)和家蠶保幼激素酯酶基因(BmJHE)[43]等進(jìn)行功能分析。

定向改造突變體是以已明確功能的內(nèi)源基因?yàn)榘谢?，利用基因組靶向編輯技術(shù)獲得敲除靶基因并具有特定表型差異的突變體。如利用TALEN技術(shù)敲除家蠶BmdsxF基因建立的外生殖器和蠶卵發(fā)育異常的雌特異性不育家蠶系[38]，并在此基礎(chǔ)上利用CRISPR/Cas9進(jìn)一步證實(shí)BmPSI和BmMasc基因的突變影響B(tài)mdsx的剪切，導(dǎo)致雌性生殖器官出現(xiàn)在雄性外生殖器中[44]；通過TALEN技術(shù)敲除BmFib-H基因，創(chuàng)制可作為理想的生物反應(yīng)器的不分泌內(nèi)源Fib-H蛋白的“絲膠繭”突變體[35,36]；通過CRISPR/Cas9敲除家蠶胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因BmWnt1獲得蠶卵不孵化且體節(jié)發(fā)育和色素沉積異常突變體[45]等。

2.2.2 基因組結(jié)構(gòu)變異

該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)同時對2個或2個以上的靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，在基因組內(nèi)實(shí)現(xiàn)長度大于1 kb的DNA片段的缺失、易位、重復(fù)、插入、倒位以及DNA拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)[40]。利用TALEN技術(shù)實(shí)現(xiàn)的家蠶基因組結(jié)構(gòu)變異研究顯示，在胚胎中同時注射2對TALEN的mRNA時，可介導(dǎo)長達(dá)8.9 Mb的染色體片段的刪除、翻轉(zhuǎn)和重復(fù)[46]，并獲得BmBLOS2基因序列區(qū)域約800 bp DNA片段缺失的人工突變體家蠶[47]。利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)了家蠶BmBLOS2基因區(qū)域長度約3.5 kb DNA大片段的高效刪除，成功得到可穩(wěn)定遺傳的油蠶突變體[48]。利用CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體系統(tǒng)在家蠶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了BmBLOS2基因區(qū)域長達(dá)3.2 kb DNA大片段的刪除和倒位等GSVs操作[33]。

2.2.3 外源基因的基因組定點(diǎn)整合

該操作是利用基因組靶向編輯技術(shù)在基因組特定位點(diǎn)造成雙鏈斷口，利用NHEJ或HR等DSB修復(fù)機(jī)制將外源基因定點(diǎn)敲入。利用ZFN介導(dǎo)產(chǎn)生DBS后，基于HR途徑實(shí)現(xiàn)了外源GFP基因在家蠶基因組的定點(diǎn)整合，但效率僅為0.0085%，暗示家蠶DSB修復(fù)主要通過NHEJ途徑實(shí)現(xiàn)[49]。此后利用以Bmku70基因?yàn)榘袠?biāo)的sgRNA表達(dá)載體與Cas9的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染BmN4細(xì)胞，采用T7核酸內(nèi)切酶(T7EI)檢測基因型的結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效介導(dǎo)高達(dá)30.3%的靶基因編輯[50]。利用TALEN介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了攜帶同源臂序列的由組成型hr5-ie1啟動子組合調(diào)控的DsRed2基因在家蠶BmBLOS2基因靶位點(diǎn)的定點(diǎn)整合[51]。根據(jù)基于微同源重組介導(dǎo)末端連接(microhomology mediated end joining, MMEJ)的修復(fù)途徑，利用TALEN和CRISPR/Cas9建立了結(jié)合目標(biāo)染色體精確整合(precise integration into target chromosome, PITCh)系統(tǒng)的外源基因整合策略(TAL-PITCh, CRIS-PITCh)，并實(shí)現(xiàn)了外源基因在家蠶BmBLOS2基因編碼區(qū)的定點(diǎn)整合[52]。

2.2.4 外源基因的點(diǎn)突變敲除

近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被用于進(jìn)行外源基因的點(diǎn)突變敲除。Dong等[53]在BmN-SWU1細(xì)胞中構(gòu)建了一種持續(xù)性或病毒誘導(dǎo)性定點(diǎn)敲除的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，可在病毒感染后被迅速激活，切割家蠶核型多角體病毒(BmNPV)復(fù)制早期必需基因ie-1，從而有效抑制病毒增殖，顯著地提高BmN-SWU1細(xì)胞抗BmNPV增殖的能力。Chen等[39]利用家蠶piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功建立了可持續(xù)性敲除BmNPV基因組ie-1基因和me53基因的轉(zhuǎn)基因家蠶，添毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因家蠶具有顯著的抗BmNPV能力。

3 柞蠶基因編輯技術(shù)應(yīng)用展望

3.1 柞蠶基因組靶向編輯技術(shù)的路徑選擇

2014年由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所等6家柞蠶科研單位組成的柞蠶基因組研究聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目組與深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合作，利用第二代高通量測序技術(shù)完成了柞蠶基因組de novo測序工作。2020年《Molecular Ecology Resources》雜志報道了利用第三代高通量測序技術(shù)完成柞蠶染色體基因組的組裝[54]。柞蠶基因組研究成果的公開發(fā)表，標(biāo)志著柞蠶研究后基因組時代的開啟，為進(jìn)一步解析柞蠶重要基因功能，明確關(guān)鍵基因的代謝通路等創(chuàng)造了條件。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)問世以來，因其載體構(gòu)建簡單快速、易操作、省時省力、周期短，且適用于絕大多數(shù)物種的特點(diǎn)，迅速推動了生物基因編輯研究的發(fā)展，已經(jīng)在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、家蠶等昆蟲的基礎(chǔ)研究中得到廣泛應(yīng)用。家蠶作為鱗翅目模式昆蟲與模式生物，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開展基因編輯已經(jīng)取得顯著成果，柞蠶與家蠶相比存在著特性差異(柞蠶基因組重復(fù)序列異常豐富[54]、密碼子偏好差異等)與局限性(卵殼更厚、以蛹滯育、需野外放養(yǎng)等)，這些勢必會增加柞蠶基因組靶向編輯工作的難度，但相信CRISPR/Cas9系統(tǒng)一定能夠在柞蠶功能基因組研究中發(fā)揮重大作用。

3.2 內(nèi)源靶基因定點(diǎn)敲除效率低的問題

盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于許多物種的基因組編輯研究，但由于物種間差異及特異性，該系統(tǒng)在不同物種間介導(dǎo)內(nèi)源基因定點(diǎn)敲除的效率差別較大。將Cas9蛋白mRNA及sgRNA導(dǎo)入發(fā)育早期的家蠶胚胎，獲得的內(nèi)源靶基因定點(diǎn)敲除效率較低。為提高Cas9蛋白的瞬時表達(dá)效率與含量，目前有效的策略是采取密碼子優(yōu)化型Cas9蛋白編碼基因[50]，強(qiáng)啟動活性、組成型或生殖腺等組織特異型啟動子組合驅(qū)動或持續(xù)驅(qū)動Cas9蛋白編碼基因表達(dá)[38,44,55]，以及構(gòu)建基于質(zhì)粒DNA的包含U6啟動子的Cas9載體系統(tǒng)等方法提高敲除效率。

3.3 脫靶效應(yīng)問題

基因組編輯的脫靶效應(yīng)是指EEN蛋白或sgRNA與非靶標(biāo)DNA序列發(fā)生錯配，并引入非預(yù)期基因突變的現(xiàn)象。造成脫靶效應(yīng)的因素較為復(fù)雜，目前主要采取以下兩方面改善措施。首先，根據(jù)物種特性、靶位點(diǎn)序列特征等選擇適合的基因組編輯工具，并通過CRISPR Design和CRISPRdirect等在線軟件設(shè)計(jì)sgRNA、改變切口酶策略、采用新型Cas9蛋白、采用突變體Cas蛋白與FokⅠ形成的融合蛋白、采用細(xì)胞穿透肽來介導(dǎo)Cas9蛋白與sgRNA進(jìn)入宿主細(xì)胞等方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。其次，就是建立簡單、快速有效的脫靶效應(yīng)檢測方法。目前家蠶中主要應(yīng)用的仍是克隆檢測，此外基于高通量測序的ChIP-seq技術(shù)、GUIDE-seq技術(shù)、整合酶缺陷的慢病毒載體(IDLV)檢測法和Digenome-seq技術(shù)等都能夠檢測全基因組范圍的脫靶效應(yīng)[40]。

3.4 新型CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用

近幾年公布了2種具有高效基因編輯能力的新型CRISPR基因編輯系統(tǒng)：CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas12b。它們與Cas9同屬于Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)，但在蛋白大小與結(jié)構(gòu)、PAM識別位點(diǎn)、靶向過程、靶標(biāo)序列剪切結(jié)果、位點(diǎn)特異性、脫靶率等方面有所差異，很好地彌補(bǔ)了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的局限性[56]，同樣適合應(yīng)用于家蠶基因組編輯研究。可以預(yù)見，柞蠶基因組靶向編輯技術(shù)的應(yīng)用將有效促進(jìn)柞蠶業(yè)基礎(chǔ)科研水平的提高，推動柞蠶品種的遺傳改良，提升柞蠶產(chǎn)品開發(fā)等綜合利用潛力，鞏固我國柞蠶產(chǎn)業(yè)在世界上的領(lǐng)先地位。