李 偉， 李雙霞， 孟元華， 李鳳玉， 張奇芳， 熊正文， 田玉旺， 牛曉東

陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院1.病理科；2.檢驗(yàn)科；3.腫瘤科；4.麻醉科，河北 張家口 075000；5.張家口市第一人民醫(yī)院 超聲科，河北 張家口 075000；6.解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心 病理科，北京 100700

乳腺葉狀腫瘤(phyllode tumor of the breast，PTB)[5]由上皮成分與纖維結(jié)締組織組成，呈分葉狀，根據(jù)世界衛(wèi)生組織腫瘤標(biāo)準(zhǔn)分為良性、交界性與惡性3種類(lèi)型[1-2]。PTB臨床癥狀為單側(cè)無(wú)痛硬質(zhì)包塊[3]。惡性PTB發(fā)病率極低，占比22%左右，好發(fā)于中年女性，并且部分患者腫瘤生長(zhǎng)期漫長(zhǎng)，可達(dá)多年，并且具有較高的局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[2]。PTB的組織學(xué)分級(jí)與預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步明確PTB預(yù)后相關(guān)因素具有重要意義[4]。Piwil樣蛋白2(P-element-induced wimpy testis like 2，Piwil2)屬于PIwI亞家族成員之一，在自我發(fā)育更新、RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以及誘導(dǎo)沉默中具有重要意義[5]。Piwil2可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌癥的發(fā)生，在多種癌組織中異常高表達(dá)[6-7]。細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，Stat3)為STAT家族成員之一，與癌癥等多種疾病的發(fā)展有關(guān)。有研究顯示，Stat3高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與增殖[8]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于Piwil2、Stat3與惡性PTB相關(guān)性的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)Piwil2、Stat3在惡性PTB組織中的表達(dá)情況，分析二者與惡性PTB的相關(guān)性，以期為惡性PTB的臨床分析及判斷患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況提供參考依據(jù)[7]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 將自2000年3月至2012年6月陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院和解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心收治的153例女性PTB患者的乳腺組織納入PTB組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2012年世界衛(wèi)生組織惡性葉狀腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；均為首次接受住院治療；術(shù)前未進(jìn)行其他輔助性治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期進(jìn)行過(guò)化療或手術(shù)等治療；合并其他免疫系統(tǒng)疾病者。另將同期收治的70例乳腺炎患者切除的乳腺正常組織納入對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及方法 兔抗人Piwil2多克隆抗體(PAB27177)購(gòu)自艾美捷科技有限公司；Stat3多克隆抗體(ABP0124)購(gòu)自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑(CTS010)購(gòu)自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購(gòu)自上海一基實(shí)業(yè)有限公司。對(duì)照組取術(shù)中切除的乳腺正常組織作為樣本，PTB組取手術(shù)切除腫瘤組織作為樣本。生理鹽水沖洗組織樣本，甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度5 μm，二甲苯進(jìn)行脫蠟、水化、PBS沖洗5 min。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SP法染色，再采用蘇木精復(fù)染、重新水化后封片觀察。

1.3 結(jié)果判定及隨訪 根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行分類(lèi)：未染色0分，染色弱陽(yáng)性1分(淡黃色)，染色強(qiáng)陽(yáng)性3分(黃褐色)，弱陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性之間的陽(yáng)性染色為2分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占比可分為：占比≤5%為0分；5%<占比<25%為1分；25%≤占比≤50%為2分；占比>50%為3分[10]。兩項(xiàng)評(píng)分乘積即染色指數(shù)(staining index，SI)：陰性(-)，SI≤1；弱陽(yáng)性(+)，1

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料用例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)分析檢驗(yàn)Piwil2、Stat3表達(dá)在惡性PTB組織中的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTB術(shù)后隨訪情況 PTB患者共153例(71例良性PTB、32例交界性PTB、50例惡性PTB)，腫瘤復(fù)發(fā)共18例(2例良性PTB、6例交界性PTB、10例惡性PTB)，無(wú)復(fù)發(fā)135例。采用腫物單獨(dú)切除術(shù)、腫物擴(kuò)大切除術(shù)、乳房切除術(shù)對(duì)患者進(jìn)行治療，共有6例患者于術(shù)后2～38個(gè)月內(nèi)死亡(1例交界性PTB、5例惡性PTB)，其中4例發(fā)生不同程度的肺部、骨骼轉(zhuǎn)移致死，2例復(fù)發(fā)性致死；良性PTB患者5年內(nèi)未發(fā)生轉(zhuǎn)移和死亡。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率隨良性、交界性、惡性3種類(lèi)型腫瘤病理學(xué)分級(jí)程度增加而增大，并隨手術(shù)范圍擴(kuò)大而減小。PTB患者5年內(nèi)總生存率為96.08%(147/153)，其中良性、交界性、惡性PTB患者生存率分別為100.00%(71/71)、96.88%(31/32)、90.00%(45/50)。

2.2 Piwil2、Stat3在惡性PTB組織、正常組織中表達(dá)情況 Piwil2蛋白在惡性PTB組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為均80.00%(40/50)，顯著高于對(duì)照組的24.29%(17/70)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Stat3蛋白在惡性PTB組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為均78.00%(39/50)，顯著高于對(duì)照組的20.00%(14/70)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Piwil2、Stat3在惡性PTB組織、正常組織中表達(dá)情況(a.Piwil2在正常組織中陰性表達(dá)；b.Piwil2在惡性PTB組織中陽(yáng)性表達(dá)；c.Stat3在正常組織中陰性表達(dá)；d.Stat3在惡性葉狀腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá))

2.3 Piwil2、Stat3表達(dá)在惡性PTB組織中的相關(guān)性 50例惡性PTB患者中，35例患者Piwil2蛋白、Stat3蛋白均表達(dá)為陽(yáng)性，6例患者均表達(dá)為陰性，5例患者Piwil2陽(yáng)性表達(dá)而Stat3陰性表達(dá)，4例患者Stat3陽(yáng)性表達(dá)而Piwil2陰性表達(dá)。Piwil2、Stat3的表達(dá)在惡性PTB組織中存在正相關(guān)性(r=0.459，P<0.05)。

2.4 惡性PTB患者Piwil2、Stat3與臨床病理特征關(guān)系 Piwil2、Stat3在惡性PTB組織的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、同側(cè)或?qū)?cè)纖維腺瘤病史有相關(guān)性(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 惡性PTB患者Piwil2、Stat3與臨床病理特征關(guān)系/例(百分率/%)

3 討論

惡性PTB是起源于小葉內(nèi)或?qū)Ч苤車(chē)g質(zhì)的一種極為少見(jiàn)的惡性腫瘤，病理特征常表現(xiàn)為葉狀結(jié)構(gòu)、核異性及分裂象、間質(zhì)旁腺體增生現(xiàn)象嚴(yán)重，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚[9-14]。雖然惡性PTB發(fā)病率較低，但具有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，嚴(yán)重威脅患者的健康及生活質(zhì)量。采用腫物單獨(dú)切除術(shù)、腫物擴(kuò)大切除術(shù)、乳房切除術(shù)3種術(shù)式均可治療PTB患者[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，良性PTB患者術(shù)后5年內(nèi)未發(fā)生轉(zhuǎn)移和死亡，交界性和惡性PTB均具有存在復(fù)發(fā)，并且惡性PTB同時(shí)具有較大的轉(zhuǎn)移性；根據(jù)病情不同嚴(yán)重程度選擇恰當(dāng)?shù)男g(shù)式，以降低術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況的發(fā)生。Piwil2在成人體細(xì)胞和干細(xì)胞中表達(dá)沉默，但在結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胃腸道腫瘤等多種癌癥中異常表達(dá)，不受腫瘤和組織類(lèi)型的限制，而且與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后不良相關(guān)[5-6，16]。有研究表明，Piwil2在腫瘤細(xì)胞中與核轉(zhuǎn)錄因子κB/p65共表達(dá)，二者協(xié)同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而定量檢測(cè)其表達(dá)可用于預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)展情況[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，Piwil2可通過(guò)表觀遺傳調(diào)控促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞到腫瘤起始細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，Piwil2在乳腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，猜測(cè)Piwil2可能調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制[18]。

有研究表明，STATs作為細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)的下游效應(yīng)物在多種癌細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中發(fā)揮作用[19]。Stat3可通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，以此參與腫瘤的發(fā)生，且Stat3表達(dá)增加與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Stat3蛋白在惡性PTB組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為均78.00%(39/50)，顯著高于對(duì)照組的20.00%(14/70)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示，Stat3可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，參與到惡性PTB的發(fā)生過(guò)程中。有研究顯示，Piwil2表達(dá)上調(diào)與Stat3表達(dá)增加相關(guān)，其通過(guò)上調(diào)Stat3基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期從G0/1到S期的轉(zhuǎn)變以及核因子κB的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖以及抑制細(xì)胞凋亡[6]。Piwil2過(guò)表達(dá)可激活內(nèi)源性RNA，增強(qiáng)Stat3/Bcl-xl、Stat3/CynlinD1信號(hào)通路，從而參與腫瘤的發(fā)生[7]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Piwil2、Stat3的表達(dá)在惡性PTB組織中存在正相關(guān)性。這表明，Piwil2、Stat3可能通過(guò)協(xié)同作用共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。此外，Piwil2、Stat3在惡性PTB組織的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、同側(cè)或?qū)?cè)纖維腺瘤病史有關(guān)，提示二者可能參與疾病進(jìn)展。

綜上所述，Piwil2、Stat3在惡性PTB組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加，其陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、同側(cè)或?qū)?cè)纖維腺瘤病史呈正相關(guān)性。Piwil2、Stat3可作為惡性PTB臨床監(jiān)測(cè)檢測(cè)指標(biāo)，用以檢測(cè)患者臨床癥狀特征，進(jìn)行更有針對(duì)性的治療。