智潔 李亞星 綜述 賈漪濤 審校

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率均居第3 位[1]。在中國，隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展以及人們生活方式的改變，其發(fā)病率已上升至惡性腫瘤的第3 位，且呈逐年攀升的勢態(tài)[2]。外泌體是一類直徑約40～100 nm 的脂質(zhì)雙分子層微小囊泡，廣泛分布于人體中，富含多種生物活性分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA、microRNA 及長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等，在細胞間信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用。lncRNA 為長度大于200 nt 的非編碼RNA，可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可通過lncRNA 參與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。近幾年來，越來越多的學(xué)者開始致力于研究外泌體lncRNA 在結(jié)直腸癌中的作用，并取得了一些重要突破。

1 外泌體lncRNA 的生物學(xué)特性

lncRNA 通常不具備蛋白質(zhì)編碼能力，在外泌體和微泡的保護下，可穩(wěn)定地存在于組織體液中，且不受內(nèi)源性RNA 酶影響[4,5]。外泌體lncRNA 在細胞間生物信息的遠距離傳遞過程中發(fā)揮重要作用[6]。目前，研究者們通常認為，lncRNA 主要通過以下機制參與調(diào)控基因的表達：1）表觀遺傳水平：lncRNA 可通過DNA 甲基化或去甲基化、組蛋白修飾及染色體重塑等方式在表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控基因表達，導(dǎo)致目標基因的表觀遺傳沉默或激活，例如lncRNA SNHG1 可以直接與起始復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）相互作用，促進Krueppel 樣因子2（Krueppellike factor 2，KLF2）和周期素依賴性激酶抑制因子2B（cyclin dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B）啟動子的組蛋白甲基化，介導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]；2）轉(zhuǎn)錄水平：lncRNA 可與轉(zhuǎn)錄因子、增強子或啟動子相互作用，調(diào)控RNA 轉(zhuǎn)錄、定位和穩(wěn)定性，例如lncRNA TCF7 通過招募BAF170 可激活TCF7（transcription factor 7，TCF7）啟動子并促進TCF7 表達，過表達的TCF7 則能加速結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲[8]；3）轉(zhuǎn)錄后水平：lncRNA 可通過堿基互補配對與靶mRNA 形成RNA 二聚體，阻礙其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，或直接募集某些翻譯抑制蛋白，或直接與miRNA相互作用，調(diào)控mRNA 的剪切、翻譯和降解，例如lncRNA GAS5 高表達通過作用于miR-221 可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-10]。lncRNA 還可以通過海綿吸附miRNA 發(fā)揮拮抗作用，阻斷miRNA對其下游靶mRNA 的抑制作用，導(dǎo)致內(nèi)源性的靶點過表達，即競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）機制。例如：lncRNA CRNDE 在結(jié)直腸癌組織中呈高表達狀態(tài)，可通過抑制miR-181a-5p導(dǎo)致下游的靶基因 β-catenin 和轉(zhuǎn)錄因子4（transcription factor 4，TCF4）表達升高，活化Wnt/β-catenin 信號通路，促進腫瘤細胞增殖，導(dǎo)致耐藥[11]。不僅如此，在結(jié)直腸癌中，lncRNA 還可直接與靶蛋白結(jié)合間接調(diào)控靶基因的表達。Ling 等[12]發(fā)現(xiàn)，lncRNACCAT2 可直接與轉(zhuǎn)錄因子7 類似物2（transcription factor 7-like 2，TCF7L2）結(jié)合，激活Wnt/ β-catenin，上調(diào)MYC 表達，加速腫瘤進展。探索lncRNA 在結(jié)直腸癌中的相關(guān)調(diào)控機制有助于研究者了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的確切機制，為結(jié)直腸癌治療提供新的視角。

2 外泌體lncRNA 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用

在特定信號的“指示”下，結(jié)直腸癌細胞能夠“選擇”特異性的lncRNA 及其他活性物質(zhì)進入外泌體中，外泌體則攜帶這些活性成分到達靶細胞發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能。Cha 等[13]發(fā)現(xiàn)，KRAS 突變可影響結(jié)直腸癌細胞特異性的外泌體miRNA 輸出，但對外泌體lncRNA 的輸出過程并未顯現(xiàn)出同樣的作用。有研究者進一步采用了基于CRISPR/Cas9 的RNA 追蹤系統(tǒng)進行監(jiān)測，旨在通過引導(dǎo)RNA（gRNA）動態(tài)觀察lncRNA靶向至特定基因組位點的過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶lncRNA輸出信號的gRNA 能夠從供體細胞移至新的靶細胞，與特定的基因位點結(jié)合，而這一過程的發(fā)生與KRAS突變并無相關(guān)性，表明結(jié)直腸癌細胞可能通過一種尚未闡明的機制選擇性地輸出不同類型的lncRNA[14]。

腫瘤細胞分泌的lncRNA 被外泌體輸送到達靶細胞，一方面可以在遠處產(chǎn)生適合腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的微環(huán)境（即轉(zhuǎn)移前生態(tài)位，pre-metastatic niche，PMN）；另一方面還可直接作用于其他腫瘤細胞，改變腫瘤細胞本身的特性，甚至改變腫瘤的代謝編程，最終加速腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥的產(chǎn)生[15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中的外泌體源性lncRNARPPH1 表達明顯上調(diào)，它既可通過與TUBB3 結(jié)合防止其泛素化，誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；又可與腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）相互作用，促進TAM 向M2 型極化，從而加速腫瘤進展[18]。另有研究顯示，無論是在腫瘤相關(guān)成纖維細胞還是結(jié)直腸癌細胞來源外泌體中，lncRNAH19 均呈高表達，該lncRNA 可競爭性結(jié)合miR-141，激活β-catenin 信號通路，參與并維持結(jié)直腸癌干細胞的干性狀態(tài)，導(dǎo)致結(jié)直腸癌對化療藥物的抵抗[19]。Gao 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞來源外泌體中的lncRNA 91H 能夠促使異質(zhì)性胞核核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，HNRNPK）表達升高，顯著增加結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲能力（圖1）。

圖1 lncRNA 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)機制

結(jié)直腸癌中還有一種獨特的現(xiàn)象，即lncRNA UCA1在癌組織和外泌體中的表達呈現(xiàn)出分離的趨勢：lncRNA UCA1 在結(jié)直腸癌細胞中表達升高，但在外泌體中表達卻明顯下降。研究者推測這可能是腫瘤細胞“限制”了lncRNA UCA1 進入到外泌體中，而“為己所用”，以促進自身的發(fā)生發(fā)展。進一步研究證實，lncRNA UCA1 可與miR-135a、miR-143、miR-214和miR-1 271 結(jié)合，促進ANLN、BIRC5、IPO7、KIF2A、KIF23 等mRNA 表達，而功能富集的結(jié)果提示這些蛋白表達升高又與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（圖1）[21]。這一現(xiàn)象的確切機制、臨床意義值得深入研究。

lncRNA 亦可參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的代謝重編程而影響腫瘤的進展。Chen 等[22]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，有氧糖酵解顯著的腫瘤細胞周圍通常伴隨著大量巨噬細胞浸潤，而糖酵解的存在與腫瘤細胞的凋亡水平呈負相關(guān)。巨噬細胞來源的外泌體可攜帶lncRNA HISLA到達腫瘤細胞，通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）與其羥化酶2（prolyl hydroxylase 2，PHD2）的結(jié)合而減少HIF-1α 的降解，從而促進腫瘤細胞持續(xù)增殖。目前結(jié)直腸癌中尚缺乏外泌體lncRNA 與代謝調(diào)控的相關(guān)研究，需進一步的實驗探究。

3 外泌體lncRNA 在結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后評估中的價值

外泌體lncRNA 在組織體液中穩(wěn)定性良好，且其含量變化可反映出個體的生理病理狀態(tài)，近年來研究人員就其診斷價值進行了廣泛的研究。現(xiàn)已證實，lncRNA CCAT2 在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌和肝癌等多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及血清外泌體源性的lncRNA CCAT2 均顯著升高，而術(shù)后血清水平明顯下降，提示其有望成為結(jié)直腸癌診斷的潛在預(yù)測因子[23]。一項基于基因芯片的生物信息學(xué)分析顯示，外泌體來源的LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266 、LNCV6_84003 和LNCV6_98602 在早期結(jié)直腸癌患者的血漿中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，研究者進一步通過ROC 曲線對其準確性進行了驗證，表明其可作為早期診斷結(jié)直腸癌的有效血清學(xué)標志物[24]。另有研究表明，lncRNA CRNDE-h在區(qū)分結(jié)直腸癌患者與良性結(jié)腸疾病、健康人群方面甚至優(yōu)于CEA（敏感性為70.3%vs.37.16%，特異性為94.4%vs.88.75%）。當兩種標記物聯(lián)合使用時，可更加準確地預(yù)測結(jié)直腸癌患者的總生存，聯(lián)合檢測外泌體lncRNA CRNDE-h 和CEA 水平，可能會得到更高的腫瘤檢出率[25]。由此可見，外泌體lncRNA 作為腫瘤標志物，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，臨床應(yīng)用的潛力很大。

另外，外泌體lncRNA 在結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估中也有一定的價值。Liu 等[25]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細胞外泌體源性的lncRNA CRNDE-h 不僅具有一定的臨床診斷價值，更是與結(jié)直腸癌的預(yù)后密切相關(guān)。與結(jié)直腸良性疾病或健康人群相比，結(jié)直腸癌患者血清中外泌體源性的lncRNA CRNDE-h 表達明顯升高，其高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其它部位遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，還與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后呈負相關(guān)。相反，lncRNA GAS5 作為抑癌基因，在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織、血清及外泌體中表達均是下調(diào)的。外泌體源性的lncRNA GAS5 高表達可通過作用于miR-221 而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達水平升高與腫瘤患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)（局部復(fù)發(fā)率為55.06%vs.58.99%，P<0.05；遠處轉(zhuǎn)移率為29.75%vs.33.09%，P<0.05），與3年總生存期呈正相關(guān)（67.72%vs.64.75%，P<0.05）[26]。Baassiri 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA APC1 在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯降低，這類結(jié)直腸癌更易發(fā)生淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，臨床分期更晚，預(yù)后更差（41.4 個月vs.64.3 個月，P<0.05）。相關(guān)機制研究證實，lncRNA APC1 低表達時可激活MAPK 信號通路誘導(dǎo)腫瘤血管形成，加速腫瘤的進展；APC 基因能夠通過抑制PPARα 在lncRNA APC1 啟動子上的富集而增加lncRNA APC1 的表達，當lncRNA APC1 表達上調(diào)時可直接與Rab5b mRNA 結(jié)合，降低其穩(wěn)定性，同時減少外泌體的產(chǎn)生，最終抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[28]。上述研究結(jié)果為外泌體lncRNA 作為結(jié)直腸癌患者的潛在預(yù)后預(yù)測標志物提供了有力依據(jù)。

4 外泌體lncRNA 在結(jié)直腸癌治療中的價值

近年來，結(jié)直腸癌內(nèi)科治療特別是藥物治療雖已取得可觀的成效，但仍面臨著耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)等問題，尋找新的治療策略十分必要?，F(xiàn)已證實，腫瘤細胞可通過分泌外泌體，攜帶多種lncRNA 進入腫瘤細胞，介導(dǎo)耐藥的發(fā)生[29]。例如，結(jié)直腸癌中的成纖維細胞可通過其所分泌的外泌體將lncRNA CCAL 傳遞給腫瘤細胞，lncRNA CCAL 進一步與HuR 蛋白相互作用，激活β-catenin 信號通路，介導(dǎo)癌細胞對奧沙利鉑和5-Fu 的耐藥，而下調(diào)lncRNA CCAL 的表達可延緩甚至逆轉(zhuǎn)這一過程的發(fā)生[30]。Yang 等[31]還發(fā)現(xiàn)，lncRNA UCA1 在對西妥昔單抗耐藥的結(jié)直腸癌細胞及其外泌體中表達明顯增高，且在進展期腸癌患者外周血外泌體中的表達水平亦明顯升高。如前所述，lncRNA UCA1 本身在癌細胞和外泌體中的表達呈現(xiàn)出分離的趨勢（即在細胞中高表達，在外泌體中低表達），提示外泌體能夠通過lncRNA UCA1 介導(dǎo)西妥昔單抗耐藥，抑制外泌體源性lncRNA UCA1 的表達有望逆轉(zhuǎn)或延緩獲得性耐藥的發(fā)生。探索外泌體lncRNA 對結(jié)直腸癌藥物耐藥的影響將有助于進一步闡明結(jié)直腸癌耐藥的分子機制，為克服或逆轉(zhuǎn)耐藥提供新思路（表1）。

表1 結(jié)直腸癌中l(wèi)ncRNA 表達與診斷、預(yù)后和治療之間的研究進展

當前研究仍局限于外泌體lncRNA 與結(jié)直腸癌耐藥之間的相互影響，具體機制尚不明確。而現(xiàn)有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境、腫瘤代謝的改變同樣與結(jié)直腸癌治療密切相關(guān)[32]。外泌體lncRNA 到達相應(yīng)的靶細胞后亦可能通過影響局部免疫微環(huán)境，調(diào)節(jié)靶細胞的糖代謝、脂質(zhì)代謝，對結(jié)直腸癌治療療效產(chǎn)生影響。然而目前相關(guān)的研究依舊匱乏，需進一步探索其中的機制。

此外，外泌體lncRNA 作為細胞間的通訊工具，具效率高、靶向性強等優(yōu)勢，可作為藥物載體用于靶向治療，在臨床治療中有著較強的應(yīng)用前景。靶向作用于外泌體lncRNA，調(diào)控外泌體lncRNA 細胞間通訊為結(jié)直腸癌精準治療提供了新的領(lǐng)域和方向。

5 結(jié)語

LncRNA 與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些異常表達的lncRNA 能夠通過影響癌癥相關(guān)的關(guān)鍵信號通路，促進或抑制結(jié)直腸癌的進展。由于外泌體在體液中濃度較高，易于富集，其所包含的lncRNA 能長期穩(wěn)定存在，所以能夠及時、準確地反映疾病進展、治療反應(yīng)及轉(zhuǎn)歸。一方面，液態(tài)活檢標本中外泌體lncRNA表達的特異性改變可能有助于結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后評估；另一方面，lncRNA 作為潛在的藥物靶點，將來可用于研發(fā)新的抗癌藥物。如今，免疫治療為眾多腫瘤患者帶來了生存獲益，但結(jié)直腸癌患者往往對免疫治療不敏感[33]。外泌體lncRNA 可與結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境相互作用，或許能成為提示結(jié)直腸癌患者免疫治療效果的一個重要指標。

當然，目前針對外泌體lncRNA 的研究依舊存在許多問題，如：1）外泌體源性lncRNA 之間的交互作用尚不明確；2）尋找對結(jié)直腸癌的進展、耐藥、免疫耐受影響最大的lncRNA 仍面臨挑戰(zhàn)；3）結(jié)直腸癌中外泌體lncRNA 水平及作用與其他腫瘤的差異及背后的機制值得深入研究；4）不同的lncRNA 在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能存在時空動態(tài)性，其中的意義有待闡明。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、高通量測序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及生物信息學(xué)分析等技術(shù)的快速發(fā)展，研究者對外泌體lncRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的機制及其臨床應(yīng)用價值的認識將不斷深入。外泌體lncRNA 在不久的將來很有可能會成為結(jié)直腸癌早期篩查、治療、療效預(yù)測與預(yù)后評估中的研究熱點。