秦 雷,汪亞男,謝宗玉,朱廣輝,郭 飛,馬宜傳

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，病死率及致殘率很高，約40%的病人出血后48 h內(nèi)死亡[1]，已廣泛引起人們的關(guān)注與重視。近年來(lái)研究[2]顯示，改善大血管痙攣并不能明顯改善SAH病人的預(yù)后，早期腦損傷(EBI)可能是導(dǎo)致SAH病人死亡風(fēng)險(xiǎn)較高和決定預(yù)后的首要原因，而且其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及腦細(xì)胞及腦血管一系列的病理生理改變。全腦CT灌注成像可以動(dòng)態(tài)觀察全腦不同時(shí)間段的微循環(huán)狀況，通過(guò)血流量(CBF)、血容量(CBV)、平均通過(guò)時(shí)間(MTT)和達(dá)峰時(shí)間(TTP)多參數(shù)定量分析，間接反映EBI的進(jìn)展程度。一氧化氮(NO)是重要的血管活性物質(zhì)，能夠介導(dǎo)腦血管的舒縮反應(yīng)，影響EBI的進(jìn)展。本研究擬通過(guò)兔SAH模型的建立，研究EBI狀態(tài)下腦微循環(huán)的變化規(guī)律及與血清NO的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 新西蘭大白兔購(gòu)自蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(蘇)2017-0001，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為手術(shù)組和假手術(shù)組，2組再分為術(shù)后1 h、6 h、24 h、72 h 4個(gè)亞組，各10只，共80只。

1.2 動(dòng)物模型的建立 采用枕大池注血法制備兔SAH模型。(1)30 g/L戊巴比妥經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉，麻醉劑量為1 mL/kg。(2)動(dòng)物麻醉后取俯臥位，兔頸部剃毛并固定四肢軀干，觸摸到枕大孔邊緣后作手術(shù)切口約2.5 cm，逐層鈍性分離頸部肌肉至可觸摸到枕大孔骨緣和第二頸椎棘突。用18G穿刺針經(jīng)環(huán)枕筋膜穿刺枕大池，為模擬真實(shí)SAH，盡量不放出腦脊液。(3)在耳正中動(dòng)脈用注射器抽取約5 mL血液。(4)迅速將血以0.5 mL/s的速度注入枕大池內(nèi)，以1.5 mL/kg的量注入，注血后迅速拔針，用紗布按壓局部1 min，并觀察周圍肌肉間隙內(nèi)無(wú)滲血后將青霉素粉末撒在傷口局部，分層縫合肌肉和皮膚。(5)術(shù)畢按頭低30°位放置約30 min，以利于血液分布在基底動(dòng)脈周圍。假手術(shù)組動(dòng)物模型的操作與SAH模型組相同，僅以等量的37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液替代自體血。

造模成功判斷指征：注血實(shí)驗(yàn)兔會(huì)出現(xiàn)如心率加快、急促呼吸甚至呼吸驟停、四肢強(qiáng)直樣改變或大小便失禁等；以及表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能障礙，如嗜睡、拒食、活動(dòng)減少等輕度神經(jīng)功能障礙，跛行、單癱等中度障礙，劃圈運(yùn)動(dòng)、行走困難、四肢癱瘓等重度障礙。本研究實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后大體標(biāo)本均發(fā)現(xiàn)不同程度的血凝塊可以證實(shí)SAH造模成功。

1.3 CT灌注成像 使用GE revolution CT，兔麻醉后俯臥位頭先進(jìn)固定于特制的掃描架內(nèi)。選擇矩陣1 024×1 024，掃描范圍8 cm，腦灌注成像操作程序，間隔1 s曝光1次，共40次。掃描前經(jīng)耳緣靜脈以1.5 mL/s流速注入非離子造影劑5 mL，注入3 s后開(kāi)始掃描。圖像后處理：將掃描數(shù)據(jù)導(dǎo)入工作站，沿著額、顳、頂、枕葉邊緣畫感興趣區(qū)(ROI)(見(jiàn)圖1),隨機(jī)軟件自動(dòng)得出CBF、CBV、MTT和TTP參數(shù)數(shù)值及相應(yīng)的偽彩圖。各灌注參數(shù)為額、顳、頂、枕各腦葉CT灌注結(jié)果的均值。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集及測(cè)定

1.4.1 血液標(biāo)本 于動(dòng)物模型建立后1、6、24、72 h，CT掃描前自兔耳緣靜脈采血2 mL；不抗凝室溫下3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存待測(cè)。用酶聯(lián)法按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定兔血清NO含量，兔血清一氧化氮(NO)試劑盒購(gòu)于廈門慧嘉生物有限公司。

1.4.2 腦組織標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于建模后1、6、24、72 h，用30 g/L戊巴比妥麻醉，CT掃描后取仰臥位，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟。剪開(kāi)左心室，將點(diǎn)滴管通過(guò)左心室插入主動(dòng)脈，打開(kāi)點(diǎn)滴管，將0.9%氯化鈉溶液快速滴注，待右心耳膨脹后剪開(kāi)，右心耳流出液變淡時(shí)，改用4%甲醛灌注，先快后慢，動(dòng)物四肢抽搐、震顫，表示灌注成功。然后開(kāi)顱，分別取兩側(cè)額葉、顳葉、枕葉、頂葉腦皮質(zhì)部分各一塊，于甲醛溶液中保存。對(duì)組織進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅染色，觀察腦組織細(xì)胞形態(tài)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析、q檢驗(yàn)和直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 兔神經(jīng)系統(tǒng)損害情況 手術(shù)組術(shù)后20只兔表現(xiàn)為異常興奮、上躥下跳，13只表現(xiàn)為淡漠、萎靡、活動(dòng)減少，4只出現(xiàn)活動(dòng)障礙或癱瘓；假手術(shù)組3只出現(xiàn)上述癥狀；其余兔未見(jiàn)明顯異常。

2.2 2組CT灌注參數(shù)比較 手術(shù)組CBV與CBF在術(shù)后1、6、24、72 h均明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)，MTT高于假手術(shù)組(P<0.05～P<0.01)；手術(shù)組TTP在術(shù)后24 h和72 h高于假手術(shù)組間(P<0.01和P<0.05)，2組術(shù)后1 h和6 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 2組CT灌注參數(shù)比較

2.3 2組血清NO含量比較 假手術(shù)組在術(shù)后1、6、24、72 h NO含量無(wú)明顯變化(P>0.05),手術(shù)組兔在術(shù)后24 h和72 h NO含量有所回升(P<0.01)；術(shù)后1、6、24、72 h手術(shù)組NO含量均明顯低于相應(yīng)假手術(shù)組(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 2組血清NO含量比較

2.4 手術(shù)組NO與CBV、CBF、MTT、TTP相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析顯示，手術(shù)組NO與MTT呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.854,P<0.05),與CBF呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.786,P<0.05)，與CBV(r=0.208,P>0.05)、TTP(r=0.311,P>0.05)間無(wú)明顯相關(guān)性。

2.5 病理結(jié)果 大體觀察：術(shù)后1 h注血組，枕大池區(qū)域、延髓腹側(cè)面可見(jiàn)血液集聚，大腦半球表面無(wú)明顯血凝塊。術(shù)后6 h注血組，少量血液集聚于枕大池區(qū)域，延髓腹側(cè)面可見(jiàn)較多血凝塊。術(shù)后24 h注血組，枕大池區(qū)及大腦半球表面較多陳舊的血凝塊。術(shù)后72 h注血組，枕大池內(nèi)未見(jiàn)明顯的血凝塊，而大腦半球腹側(cè)面可見(jiàn)少量血凝塊。假手術(shù)組大腦半球表面無(wú)明顯血凝塊(見(jiàn)圖2)。

鏡下觀察：1 h手術(shù)組，顳葉及枕葉部分小血管略狹窄，血管周圍出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；6 h手術(shù)組，額、顳、枕葉出現(xiàn)較明顯炎癥反應(yīng)，血管管腔狹窄，管壁增厚，周圍淋巴細(xì)胞增多聚集；24 h手術(shù)組，額、頂葉局部出現(xiàn)無(wú)結(jié)構(gòu)的均質(zhì)紅染的壞死區(qū)，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，顳、枕葉小血管明顯狹窄，細(xì)胞腫脹；72 h手術(shù)組，額、枕、顳葉腦組織細(xì)胞增大，水腫，胞質(zhì)增多。假手術(shù)組病理切片示腦組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞大小形態(tài)分布正常，未見(jiàn)明顯炎癥反應(yīng)和壞死灶(見(jiàn)圖3)。

3 討論

EBI是SAH后72 h內(nèi)腦作為一個(gè)整體發(fā)生的直接損傷，涉及到遲發(fā)性腦血管痙攣出現(xiàn)之前腦組織內(nèi)所發(fā)生的病理生理事件，包括腦組織細(xì)胞死亡、血腦屏障破壞、腦水腫、顱內(nèi)壓增高、急性腦血管痙攣、微血管功能障礙腦血流下降等多種病理生理事件[3-4]，這些都會(huì)造成腦缺血，引起腦細(xì)胞的凋亡及壞死，最終造成EBI。因此，了解EBI的進(jìn)展過(guò)程、機(jī)制及全腦微循環(huán)的變化規(guī)律是治療及預(yù)防的關(guān)鍵。

對(duì)于SAH后EBI的影像學(xué)檢查，常規(guī)的TCD、CTA、DSA只能反映大血管的痙攣，無(wú)法顯示微血管以及腦組織的功能情況[5]?，F(xiàn)代影像醫(yī)學(xué)已經(jīng)從單純形態(tài)學(xué)檢查向以形態(tài)學(xué)和分子水平、微循環(huán)及代謝產(chǎn)物為特點(diǎn)的功能學(xué)檢查方向發(fā)展[6]。CT灌注成像正是這樣一種功能成像，它是在靜脈團(tuán)注對(duì)比劑的同時(shí)，對(duì)選定層面進(jìn)行快速動(dòng)態(tài)CT掃描，追蹤分析對(duì)比劑首次通過(guò)受檢組織過(guò)程中每個(gè)像素的密度變化，獲得CBF、CBV、MTT和TTP定量數(shù)據(jù)及偽彩圖，可以活體評(píng)價(jià)腦內(nèi)血流的灌注狀態(tài)，能夠反映腦組織的微循環(huán)改變,是無(wú)創(chuàng)顯示腦組織缺血的最準(zhǔn)確、最敏感的方法[7]。近年來(lái)，CT灌注成像在臨床中也得到了廣泛的應(yīng)用[8]。

本研究通過(guò)分析CT灌注參數(shù)研究SAH出血早期不同時(shí)間段腦組織的微循環(huán)變化規(guī)律，從而了解EBI的進(jìn)展程度。手術(shù)組CBV低于對(duì)照組，提示由于血液刺激造成的機(jī)械性損傷、炎癥因子的釋放等造成了微血管的痙攣性狹窄，局部腦組織繼而出現(xiàn)缺血表現(xiàn)，引起了血容量的減少[9]；手術(shù)組間比較無(wú)明顯差異，可能由于EBI時(shí)腦內(nèi)微循環(huán)較宏觀血管對(duì)于刺激的反應(yīng)更加靈敏[10]，側(cè)枝循環(huán)及血流代償機(jī)制還未完全啟動(dòng)。CBF在SAH后24 h達(dá)到了最低值，72 h上升，由此可見(jiàn)，SAH早期全腦即出現(xiàn)明顯的低灌注狀態(tài)，在偽彩圖上也發(fā)現(xiàn)了較多的低灌注區(qū)域，對(duì)應(yīng)的病理切片上我們也可見(jiàn)腫脹的腦細(xì)胞、小血管的管腔狹窄等表現(xiàn)。國(guó)內(nèi)外研究[11]發(fā)現(xiàn)，SAH后早期顱內(nèi)壓的急劇升高、腦灌注壓明顯降低，導(dǎo)致腦血流量下降從而導(dǎo)致早期全腦缺血；亦有實(shí)驗(yàn)[12]表明，SAH發(fā)生后數(shù)分鐘內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞就出現(xiàn)凋亡，微血管通透性增加、血腦屏障作用破壞、炎性細(xì)胞侵入，造成了明顯的腦水腫表現(xiàn)。相關(guān)研究[13]亦發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后60 min，大腦皮層即開(kāi)始有P53表達(dá)增加，24～48 h達(dá)高峰，與本研究CBF變化規(guī)律基本一致，因此CT灌注發(fā)現(xiàn)的異常能間接反映SAH后腦缺血及腦壞死的程度。MTT在SAH發(fā)生后1 h迅速升高，6 h、24 h達(dá)到頂峰，在72 h減低，病理分析也可以發(fā)現(xiàn)血管壁增厚，管腔狹窄，周圍有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腦組織中還出現(xiàn)了無(wú)結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，可以推在第6～24 h階段腦損傷程度達(dá)到了高峰。TTP沒(méi)有MTT敏感，手術(shù)組TTP只在6 h、24 h組高于假手術(shù)組，一定程度上反映了腦組織的損傷及缺血狀態(tài)。由此可見(jiàn)，SAH后72 h內(nèi)腦組織內(nèi)發(fā)生的各種病理生理變化迅速、復(fù)雜，全腦的低灌注、缺血狀態(tài)、腦水腫、微小血管的痙攣及狹窄等會(huì)造成病人嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，甚至死亡。

研究[14]發(fā)現(xiàn)NO參與了SAH后遲發(fā)型腦血管痙攣的病理生理進(jìn)程，影響了腦微循環(huán)的改變，與EBI有著密切的關(guān)系。NO是在一氧化氮合成酶作用下產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞松弛因子，是機(jī)體重要的氣體活性分子，有舒張血管的作用，通常情況下，由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生生理劑量的NO，作用于平滑肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)腦血流及維持神經(jīng)元功能的完整性[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)SAH后1 h、6 h手術(shù)組NO含量持續(xù)減低，72 h較24 h有所升高，但較假手術(shù)組NO含量依然是減低的，在相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)NO與MTT呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與CBF呈正相關(guān)關(guān)系。CBF為單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)特定區(qū)域腦組織的血液容量，MTT理論上是血液自動(dòng)脈端流至靜脈端的循環(huán)時(shí)間，因通過(guò)的血管路徑不同，時(shí)間也不同，所以用平均通過(guò)時(shí)間表示[17],MTT增加及CBF減少意味著循環(huán)減慢，反映了微循環(huán)的障礙及腦組織的缺血狀態(tài)，因此我們推測(cè)NO可能早期就介導(dǎo)了SAH后微血管痙攣參與了腦損傷的進(jìn)程。SAH后血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，崩解釋放氧合血紅蛋白，破壞NO釋放神經(jīng)元，引起NO水平在1 h、6 h急劇下降[18]，繼而NO舒張平滑肌的能力減低及抑制內(nèi)皮素-1能力減弱，進(jìn)一步促進(jìn)了血管收縮，導(dǎo)致MTT的升高及CBF的下降。在24～72 h時(shí)段檢測(cè)到NO濃度有所上升，可能與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的激活有關(guān)[19]，iNOS活化促使膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放NO，或者是腦內(nèi)側(cè)枝循環(huán)及代償反應(yīng)的形成有關(guān)。但是手術(shù)組各期相NO含量均低于假手術(shù)組，說(shuō)明SAH早期各階段，NO都參與其中，導(dǎo)致了腦微循環(huán)及相應(yīng)的病理改變，一直影響著EBI的進(jìn)展。

綜上，CT灌注能夠反映腦組織的血流灌注狀態(tài)，提供組織器官血流動(dòng)力學(xué)信息，能較敏感地反映SAH后腦組織微循環(huán)障礙，其中CBF、MTT能很好地提示EBI的進(jìn)展程度，NO在SAH后EBI中發(fā)揮的重要作用，這些對(duì)于研究EBI的形成機(jī)制、指導(dǎo)臨床治療方案的制定和判斷臨床預(yù)后有著重要的意義。由于SAH后EBI的發(fā)生是多因素參與的，本研究?jī)H探討了NO對(duì)SAH后EBI的影響及與CT灌注參數(shù)間相關(guān)關(guān)系，未進(jìn)行多因素的綜合分析，將進(jìn)一步分析多個(gè)因素(如收縮血管因子、某些炎癥因子等)在SAH后EBI中的作用。