曹 靜，羅時(shí)成，談 笑,程 月

皮膚是最易受損傷的組織，創(chuàng)傷愈合是多種修復(fù)細(xì)胞、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的動(dòng)態(tài)修復(fù)過程，可簡單概括為3個(gè)階段：止血和炎癥反應(yīng)階段；細(xì)胞增殖分化階段；組織重塑、瘢痕形成階段[1]。皮膚創(chuàng)傷后,立即發(fā)生血管收縮、血小板聚集及纖維蛋白凝塊形成等反應(yīng),參與創(chuàng)面止血。局部炎癥反應(yīng)由纖維蛋白凝塊及聚集的血小板脫顆粒引起，炎癥階段募集的炎細(xì)胞、上皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞等分泌的生長因子誘導(dǎo)并維持細(xì)胞增生，啟動(dòng)細(xì)胞遷移。同時(shí)，創(chuàng)面內(nèi)成纖維細(xì)胞增生并合成細(xì)胞外基質(zhì),形成新生肉芽組織，隨后被重塑為早期瘢痕組織。最后,成纖維細(xì)胞凋亡,形成相對(duì)無細(xì)胞的瘢痕組織,其結(jié)構(gòu)和功能與正常皮膚組織相似[2-3]。在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中，成纖維細(xì)胞是主要修復(fù)細(xì)胞，是細(xì)胞外基質(zhì)、肉芽組織及瘢痕組織形成中的主要功能細(xì)胞[4]。黃芪入藥歷史悠久，是一味臨床上常用的中藥材。黃芪的主要活性成分是黃芪甲苷(astragaloside-Ⅳ，AS-Ⅳ)，AS-Ⅳ具有提高免疫力、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤等功效[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道[6]，在皮膚創(chuàng)傷后，給予AS-Ⅳ有助于皮膚創(chuàng)面愈合。但文獻(xiàn)研究的是較低濃度的AS-Ⅳ，并未探索較高濃度AS-Ⅳ產(chǎn)生的不利影響，忽略了藥物本身的毒性作用。本研究通過觀察AS-Ⅳ對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的細(xì)胞毒性及影響機(jī)制，為AS-Ⅳ在皮膚創(chuàng)傷治療中的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 L929細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫；AS-Ⅳ(純度>99%)購自美國MedChem Express公司；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶-EDTA消化液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK8購自美國APExBIO公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國BD Biosciences公司；γ-H2AX、cleaved Caspase-3、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠lgG、β-actin抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 主要儀器 ZHJH-C1112B型超凈工作臺(tái) (上海智城有限公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；DW-86L626型-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán))；Uvrsamax酶標(biāo)儀(美國MD公司)；CALIBUR型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Tannon-5200型化學(xué)顯色儀(上海天能有限公司)。

1.3 藥物及配制 取適量AS-Ⅳ 完全溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液中(參照MCE公司AS-Ⅳ配置說明)；臨用時(shí)將配置好的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成試驗(yàn)所需的藥物濃度，并使 DMSO 的最終濃度均小于0.3%，有研究[7-8]表明，此濃度范圍DMSO對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將L929細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液1次，定期觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)70%～80%，用含EDTA的胰酶處理傳代，選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 L929細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 選取對(duì)數(shù)生長期L929細(xì)胞，按4×105個(gè)/瓶，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)過夜待其貼壁后，設(shè)置Control組(空白對(duì)照組，未給予AS-Ⅳ)[9]、AS-Ⅳ(30、60、120 μmol/L)組和0.3% DMSO組(細(xì)胞培養(yǎng)基中DMSO濃度為0.3%)。繼續(xù)孵育培養(yǎng)12 h及24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

1.4.3 CCK8法檢測AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長期L929細(xì)胞，按5×104/mL細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，空白孔(無細(xì)胞孔)及對(duì)照孔(接種細(xì)胞但不加入AS-Ⅳ)加入完全培養(yǎng)液100 μL，實(shí)驗(yàn)組分別加入含終濃度為30、60、90、120 μmol/L AS-Ⅳ及0.3% DMSO的培養(yǎng)液100 μL，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。分別在藥物作用 6、12、24 h后，吸棄培養(yǎng)液，將10 μL CCK8溶液和90 μL無血清培養(yǎng)基添加到每個(gè)孔中，并在37 ℃下孵育2 h。在450 nm下測量各孔吸光度(OD)值[10]。

1.4.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測L929細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期L929細(xì)胞消化、重懸、調(diào)整細(xì)胞密度后接種于6孔板，置于37 ℃恒溫、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后加入不同濃度 AS-Ⅳ(30、60、120 μmol/L)干預(yù)細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞，于4 ℃、2 000 r/min 離心5 min，冷PBS洗滌2次，重懸于結(jié)合緩沖液中，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL，取細(xì)胞懸液100 μL，置于流式管中，分別加入Annexin V-FITC和PI，于避光條件下，振動(dòng)搖勻15 min，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率(包含早期凋亡及晚期凋亡)[11]。

1.4.5 Western blotting檢測γ-H2AX、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)期L929細(xì)胞消化、重懸、調(diào)整細(xì)胞密度后接種于6孔板，置于37 ℃恒溫、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后加入AS-Ⅳ處理，收集各組細(xì)胞，冰上充分裂解30 min，在4 ℃、13 000 r/min低溫離心機(jī)中離心15 min，然后吸取上清。使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。每個(gè)樣本取約40 μg總蛋白用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜用5%脫脂奶封閉2 h，將條帶對(duì)應(yīng)放入γ-H2AX、cleaved Caspase-3及β-actin抗體溶液中4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min，然后在室溫下與二抗孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL顯色后，成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測L929細(xì)胞遷移能力 L929細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，用無菌移液槍頭垂直在6孔板底部劃痕，PBS洗滌3次，換為無血清培養(yǎng)基，加入不同濃度AS-Ⅳ(30、60、120 μmol/L)及0.3% DMSO，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，在12 h及24 h使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況，并在同一視野中拍照。細(xì)胞相對(duì)遷移率=[(0 h劃痕面積-12 h/24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積]×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞形態(tài)的影響 Control組及0.3% DMSO組L929細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，多為貼壁生長的梭形及多角形細(xì)胞。與Control組相比，30、60、120 μmol/L的 AS-Ⅳ處理L929細(xì)胞12、24 h，隨給藥濃度及給藥時(shí)間增加，圓形細(xì)胞逐漸增多，懸浮細(xì)胞增多，死亡細(xì)胞逐漸增多(見圖1)。

2.2 AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞增殖的影響 30、60、90、120 μmol/L AS-Ⅳ處理L929細(xì)胞12 h和24 h，其OD值均低于Control組(P<0.05～P<0.01)。在同一處理時(shí)間(12 h、24 h)，隨著給藥濃度增加，其OD值逐漸降低(P<0.05～P<0.01)。同一濃度AS-Ⅳ處理L929細(xì)胞12 h和24 h，其OD值均低于處理6 h(P<0.05～P<0.01)。0.3% DMSO組與Control組細(xì)胞OD值隨時(shí)間增加而升高，2組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 AS-Ⅳ干預(yù)后L929細(xì)胞各組OD值比較

2.3 AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞凋亡的影響 AS-Ⅳ 30、60、120 μmol/L分別干預(yù)L929細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率均高于Control組(P<0.05～P<0.01)(見圖2、表2)。

表2 各組L929細(xì)胞凋亡率比較

2.4 AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞內(nèi)cleaved Caspase-3及γ-H2AX蛋白表達(dá)的影響 與Control組相比，AS-Ⅳ 60 μmol/L干預(yù)L929細(xì)胞6 h、12 h、24 h能升高細(xì)胞內(nèi)cleaved Caspase-3及γ-H2AX蛋白表達(dá)(P<0.05～P<0.01)(見圖3、表3)。與Control組相比，AS-Ⅳ 30、60、120 μmol/L分別處理L929細(xì)胞12 h能升高細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)(P<0.05～P<0.01)(見圖4、表4)。

表3 60 μmol/L AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞cleaved Caspase-3及γ-H2AX表達(dá)水平的影響

表4 不同濃度AS-Ⅳ干預(yù)L929細(xì)胞12 h對(duì)cleaved Caspase-3及γ-H2AX表達(dá)水平的影響

2.5 AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞遷移能力的影響 Control組與0.3%DMSO組的劃痕逐漸愈合，24 h后基本完全愈合，2組相對(duì)遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Control組相比，AS-Ⅳ 30、60、120 μmol/L分別干預(yù)L929細(xì)胞12 h及24 h，相對(duì)遷移率均下降(P<0.05～P<0.01)(見圖5、表5)。

表5 AS-Ⅳ對(duì)L929細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

皮膚組織創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜有序的過程，涉及多種組織修復(fù)細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和細(xì)胞因子相互調(diào)控[2,11-12]。成纖維細(xì)胞通過快速的增殖分化和大量合成細(xì)胞外基質(zhì)來填補(bǔ)皮膚受損區(qū)域，在傷口修復(fù)中扮演重要角色[3]。AS-Ⅳ 作為傳統(tǒng)中藥黃芪的主要成分，具有抗炎、抗氧化、降糖和改善心血管疾病等廣泛的生物活性[5]。有研究[9,13-14]發(fā)現(xiàn)，給予5 μg/mL AS-Ⅳ作用于小鼠成纖維細(xì)胞，可促進(jìn)其增殖，改善皮膚創(chuàng)面愈合。然而劑量大于30 μmol/L時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性[11]，目前關(guān)于AS-Ⅳ對(duì)成纖維細(xì)胞毒性的研究較少，本研究旨在探索AS-Ⅳ對(duì)成纖維細(xì)胞毒性及相關(guān)分子機(jī)制。

本研究通過給予不同的濃度AS-Ⅳ(30、60、90、120 μmol/L)干預(yù)L929細(xì)胞不同時(shí)間(6 h、12 h、24 h)，在同一處理時(shí)間(12 h、24 h)，隨著給藥濃度增加，其OD值逐漸降低。同一濃度AS-Ⅳ處理L929細(xì)胞12 h和24 h，其OD值低于處理6 h，這表明AS-Ⅳ濃度大于30 μmol/L時(shí)，L929細(xì)胞增殖受到不同程度抑制。30、60、120 μmol/L AS-Ⅳ干預(yù)L929細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率均高于Control組。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30、60、120 μmol/L AS-Ⅳ干預(yù)L929細(xì)胞12 h及24 h后，細(xì)胞相對(duì)遷移率下降。同時(shí)，本研究AS-Ⅳ最高濃度組的DMSO濃度為0.3%，故以此濃度作為DMSO對(duì)照組，倒置顯微鏡下觀察0.3% DMSO組與Control組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，CCK8實(shí)驗(yàn)顯示0.3% DMSO對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示0.3% DMSO對(duì)細(xì)胞遷移能力無明顯影響，可證明DMSO濃度0.3%情況下，對(duì)L929細(xì)胞無毒性，對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。

DNA受外界環(huán)境、食物、抗生素、腫瘤治療化學(xué)性藥物以及內(nèi)源性代謝物等影響而受到損傷。不同程度的損傷會(huì)引起不同的反應(yīng)，低水平的DNA損傷會(huì)觸發(fā)修復(fù)和存活機(jī)制，而高水平的損傷會(huì)觸發(fā)細(xì)胞死亡。DNA雙鏈斷裂快速觸發(fā)組蛋白H2AX的磷酸化即γ-H2AX,這是DNA斷裂啟動(dòng)修復(fù)程序的第一步，當(dāng)不能進(jìn)行修復(fù)時(shí)將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡乃至死亡[15-17]。因而γ-H2AX作為DNA損傷標(biāo)志物[18-19]。本研究結(jié)果表明，30、60、120 μmol/L AS-Ⅳ干預(yù)L929細(xì)胞12 h，γ-H2AX隨著藥物濃度增加表達(dá)增加，給予60 μmol/L AS-Ⅳ處理6 h、12 h、24 h，隨著時(shí)間增加γ-H2AX表達(dá)增加，提示L929細(xì)胞DNA損傷加重。cleaved Caspase-3作為Caspase-3活化形式，是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)[20]。與Control組相比，30、60、120 μmol/L AS-Ⅳ干預(yù)L929細(xì)胞12 h，cleaved Caspase-3表達(dá)增加，60 μmol/L AS-Ⅳ干預(yù)6 h、12 h、24 h，隨著給藥時(shí)間增加cleaved Caspase-3表達(dá)增加。且與Control組相比，30、60、120 μ mol/L AS-Ⅳ處理L929細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率升高，提示AS-Ⅳ濃度大于30 μmol/L時(shí)誘導(dǎo)L929細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，AS-Ⅳ濃度大于30 μmol/L時(shí)，抑制小鼠成纖維細(xì)胞L929的增殖、遷移并誘導(dǎo)其凋亡，說明其對(duì)L929細(xì)胞存在細(xì)胞毒性。提示AS-Ⅳ的臨床應(yīng)用需要在一定濃度范圍內(nèi)，為AS-Ⅳ在皮膚組織愈合中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。