孫夢晨，張 寧，苗秀明

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指當(dāng)孕齡婦女與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)[1]。研究表明，自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞活性失衡是RSA發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[2]。NK細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子、趨化因子以及NK細(xì)胞受體、配體數(shù)量或功能的改變均會影響NK細(xì)胞的活性，即NK細(xì)胞活性的平衡可以細(xì)化為受體、配體以及相關(guān)免疫細(xì)胞及趨化因子等分子的平衡。本文將圍繞NK細(xì)胞活性及其受體、配體等分子的調(diào)節(jié)在RSA中的作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，從分子免疫學(xué)角度研究NK細(xì)胞活性調(diào)節(jié)的機(jī)制及其在RSA發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 NK細(xì)胞的活性與正常妊娠

子宮蛻膜NK細(xì)胞(decidual NK cells,dNKs)是NK細(xì)胞中一類與正常妊娠關(guān)系密切的細(xì)胞。妊娠期間dNKs在促進(jìn)螺旋動脈重塑、調(diào)節(jié)母胎免疫耐受方面發(fā)揮重要作用，是母胎界面的主要免疫細(xì)胞，能夠通過分泌血管內(nèi)皮因子、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)等活性因子促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲蛻膜組織以及螺旋動脈的重塑，進(jìn)而利于子宮胎盤血液循環(huán)的建立，為妊娠的正常進(jìn)行、胎盤發(fā)育能力的調(diào)節(jié)提供保障[3]。此外，正常妊娠屬于同種半異體移植，需要免疫系統(tǒng)與胚胎互不排斥，NK細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)殺傷免疫球蛋白受體(kill immunoglobulin receptors，KIR)、C型凝集素樣受體(C-type lectin receptor，CLR)以及人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)等配體，傳遞激活或抑制信號來調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性，進(jìn)而在母胎界面發(fā)揮同種免疫調(diào)節(jié)作用，減弱對胎兒的排斥作用，增強(qiáng)免疫耐受。

2 NK細(xì)胞受體與NK細(xì)胞活性

NK細(xì)胞受體根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同分為KIR、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物(immunoglobulin like transcripts，ILT)、CLR及天然細(xì)胞毒性受體(natural cytotoxicity receptors，NCR)4類。其中，ILT的2個亞型ILT2和ILT4與NK細(xì)胞活性密切相關(guān)；CLR因其具有一個或多個C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域而命名，主要包括CD94/自然殺傷細(xì)胞家族2(natural killer group 2，NKG2)以及CD69和CD161等。KIR、ILT和CLR家族按功能可分為抑制性受體和活化性受體2類。

2.1 KIRKIR具有高度多態(tài)性，按單倍體分類，分為A、B型2型，A型主要包含編碼抑制基因(2DL1、2DL2、2DL3、2DL5A、2DL5B 3DL1、3DL2和3DL3)和唯一一個激活基因2DS4，而B型單倍體主要以激活基因(2DL4、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、2DS5和3DS1)為主。研究報道，RSA患者B型單倍體KIR明顯增多，抑制性KIR基因相對減少，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡[4]，因此推測KIR激活基因過多導(dǎo)致了子宮微環(huán)境的改變，從而過度激活了NK細(xì)胞的活性，最終引發(fā)RSA。然而，MANSOUR等[5]研究發(fā)現(xiàn)，主要起激活作用的B型單倍體占主導(dǎo)是保證正常妊娠的重要前提。另外，有研究表明，KIR的B型單倍體基因2DS1的激活促進(jìn)了NK細(xì)胞的激活作用，而NK細(xì)胞在一定范圍內(nèi)的活性有利于胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲蛻膜組織，對于胚胎正常著床、發(fā)育具有積極作用[5]。綜上，KIR基因多態(tài)性影響了NK細(xì)胞的功能，其抑制性受體與激活性受體共同作用使機(jī)體免疫系統(tǒng)處于一個相對平衡的狀態(tài)，這是保證成功妊娠的前提之一。

2.2 ILTILT屬于免疫球蛋白超家族，ILT2表達(dá)于NK細(xì)胞表面，ILT4表達(dá)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，ILT2與ILT4均能夠直接或間接影響NK細(xì)胞功能。陳靜等[6]研究發(fā)現(xiàn)，RSA女性的蛻膜組織中ILT4和ILT2 mRNA表達(dá)水平顯著低于健康女性。ILT2、ILT4均屬于抑制性受體，其表達(dá)下降時，對抑制性信號的傳遞以及對NK細(xì)胞活性的抑制也相應(yīng)減弱，導(dǎo)致NK細(xì)胞的活性增強(qiáng)，殺傷正常細(xì)胞，使機(jī)體對胚胎產(chǎn)生排斥作用。由于研究樣本量的限制以及對ILT與RSA之間的研究尚較少，上述結(jié)論和相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

2.3 CD94/NKG2CD94/NKG2是NK細(xì)胞受體家族成員之一，NKG2家族包括抑制性受體NKG2A以及激活性受體NKG2C、NKG2D等。NKG2A作為唯一的抑制性受體，在維持妊娠婦女母胎界面免疫平衡方面有著重要意義。劉子平等[7]研究發(fā)現(xiàn)，RSA女性蛻膜組織中NK細(xì)胞的NKG2A的表達(dá)水平明顯下降，NKG2D的表達(dá)水平明顯升高，推測可能是RSA患者的NK細(xì)胞結(jié)合了大部分CD94/NKG2中的激活性受體，導(dǎo)致激活性信號過度傳導(dǎo)，使NK細(xì)胞活性顯著增加，而活性顯著增加的NK細(xì)胞可殺傷自身其他細(xì)胞甚至胚胎，導(dǎo)致流產(chǎn)反復(fù)發(fā)生。

2.4 CD69和CD161CD69和CD161的異常表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌并引發(fā)NK細(xì)胞的殺傷活性。研究報道，子宮NK細(xì)胞(uterine natural killer cells，uNKs)中的CD161在RSA患者中表達(dá)水平較正常育齡女性明顯降低[8]，推測CD161的低表達(dá)使其與他因子的結(jié)合降低，從而降低了NK細(xì)胞原有的活性水平。與CD161比較，CD69目前在RSA領(lǐng)域乃至其他學(xué)科中的研究較少。CD69是一類能夠激活NK細(xì)胞的特異性標(biāo)志物之一，CD69水平的升高可調(diào)動機(jī)體內(nèi)同種免疫調(diào)控機(jī)制，使NK細(xì)胞殺傷活性增加，最終導(dǎo)致了機(jī)體免疫紊亂的發(fā)生[9]。研究發(fā)現(xiàn)，CD69表達(dá)水平在多次發(fā)生自然流產(chǎn)女性外周血中明顯升高，提示外周血中CD69的高表達(dá)可能是女性易患RSA的預(yù)測指標(biāo)之一[9]。

2.5 NCRNCR包括NKp46、NKp44和NKp30。其中NKp46能夠產(chǎn)生干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等細(xì)胞因子，主要表達(dá)于CD56bright與部分CD56dim細(xì)胞表面。NKp46與NK細(xì)胞的活性密切相關(guān)，dNKs中的NKp46可以介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用。研究顯示，RSA患者外周血單核細(xì)胞與胎盤中NKp46的表達(dá)水平較健康女性升高[10]。正常妊娠中NKp46未表現(xiàn)出毒性作用，其機(jī)制可能涉及2個原因，即缺失配體或其毒性活性被抑制性受體NKG2A所抑制。NKp30是另一激活性受體,有報道認(rèn)為，NKp30-a、NKp30-b亞型在RSA患者胎盤中檢測出的頻率較健康女性高，而在外周血單核細(xì)胞中與對照組無顯著差異[10]。在免疫紊亂的RSA女性中，NKp30-a和NKp30-b這2種亞型表達(dá)的變化可導(dǎo)致IFN-γ、TNF-α等促炎因子的異常表達(dá)，使dNKs過度激活而引發(fā)流產(chǎn)。

3 NK細(xì)胞配體與NK細(xì)胞活性

NK細(xì)胞的主要配體之一人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-Ⅰ類基因與NK細(xì)胞的關(guān)系密切。HLA-Ⅰ類基因分為經(jīng)典與非經(jīng)典2大類，前者包括HLA-A、HLA-B、HLA-C 3種分型，與抗原提呈和免疫調(diào)控有關(guān)；后者包括HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H，參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程。HLA-C基因是KIR的配體，在RSA患者可同時表達(dá)HLA-C型基因與KIR的特定基因，說明在HLA和KIR共表達(dá)的情況下易導(dǎo)致NK細(xì)胞功能異常。HLA-G多與NK細(xì)胞的抑制性受體如ILT2和KIR2DL4相結(jié)合，在增強(qiáng)妊娠期間的免疫耐受方面具有重要作用[11]。推測其作用機(jī)制為HLA-G 與ILT2以及KIR2DL4的結(jié)合阻斷了NK細(xì)胞活化通路，進(jìn)而阻礙了突觸活化性信號的傳輸，NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷活性作用的路徑被切斷，并且KIR2DL4與HLA-G結(jié)合后可通過分泌細(xì)胞活性因子等物質(zhì)來刺激衰老的NK細(xì)胞生成新的胎盤血管，為胚胎提供充足的血供、營養(yǎng)[12]。HLA-G通過形成先導(dǎo)序列多肽的方式誘導(dǎo)胎盤組織中 HLA-E的表達(dá)，HLA-E自身或結(jié)合其他HLA-Ⅰ類基因形成HLA先導(dǎo)肽/HLA-E復(fù)合體后，與受體NKG-2A/CD94結(jié)合而保證NK細(xì)胞的活性，對維持胚胎的血供、營養(yǎng)起到良性作用[13]。

4 其他相關(guān)免疫細(xì)胞及趨化因子對NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)

4.1 輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)1/Th2RSA患者大多數(shù)情況下同時存在NK細(xì)胞活性不足以及Th1/Th2細(xì)胞平衡偏倚的情況。研究發(fā)現(xiàn)，dNKs作用于蛻膜樹突細(xì)胞后，其表面活性物質(zhì)的表達(dá)受到抑制，且dNKs促進(jìn)了Th2型細(xì)胞的增殖[14]。Th2型細(xì)胞分泌以IL-4、IL-5和IL-10等細(xì)胞因子為主，介導(dǎo)體液免疫的發(fā)生；Th1型細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫，主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子，RSA患者Th1/Th2的平衡向Th1型細(xì)胞偏倚，使IFN-γ分泌增多，而高水平IFN-γ可導(dǎo)致NK細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致其活性異常增加而引發(fā)流產(chǎn)[15]。

4.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)/Th17Treg和Th17細(xì)胞屬于CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，Treg可通過分泌IL-10等細(xì)胞因子、抑制T細(xì)胞的分化增殖以及誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡等途徑調(diào)控機(jī)體的免疫耐受。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。dNKs能夠促進(jìn)Treg的增殖與分泌、抑制Th17細(xì)胞的增殖并促進(jìn)Th17細(xì)胞的消耗，這些功能維持了Treg/Th17的平衡，提高了妊娠期間胚胎的免疫耐受，減少了因免疫紊亂而導(dǎo)致的機(jī)體對胚胎的不良作用[16]。研究顯示，NK細(xì)胞表達(dá)水平與Th17細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而IFN-γ由NK細(xì)胞分泌，因此，NK細(xì)胞功能的改變、比例的增加可誘導(dǎo)IFN-γ對Th17細(xì)胞的殺傷作用[14]。綜上，Treg/Th17可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性，Treg/Th17失衡可引發(fā)胚胎停育。

4.2.1 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)及其配體在機(jī)體需要免疫防御時，TLR4受到刺激后激活TLR4-核因子-κB信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子發(fā)揮作用，恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)。研究顯示，RSA患者體內(nèi)TLR4基因表達(dá)水平降低，且與Treg表達(dá)水平呈正相關(guān)，與Th17細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[17]，說明TLR4可引起Treg/Th17免疫失衡。脂多糖作為TLR4的配體可激活Treg的增殖使Treg與Th17的比例保持平衡[18]。有研究報道，TLR4在體內(nèi)的過度表達(dá)可引發(fā)NK細(xì)胞對胚胎的免疫排斥[19]。另外，有研究報道，RSA患者蛻膜組織Treg中TLR9表達(dá)水平顯著降低，與配體的結(jié)合減少，最終影響Treg功能[17]。TLR9配體CpG寡核苷酸可促進(jìn)Treg的增殖、分化且同時可協(xié)調(diào)其免疫功能，從而有利于維持Treg/Th17平衡[20]。

4.2.2 B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein-1,Blimp-1)Blimp-1是一種抑制性轉(zhuǎn)錄因子，可作用于多種固有免疫細(xì)胞。有研究報道，Blimp-1在RSA患者中呈高度表達(dá)[21]，推測其原因是Blimp-1促進(jìn)了Treg增殖，抑制了Th17細(xì)胞功能，減少了Th17細(xì)胞數(shù)量，使Treg/Th17比例失衡，引發(fā)機(jī)體免疫紊亂，從而導(dǎo)致RSA的發(fā)生。

4.3 趨化因子及其受體CXC趨化因子配體16(CXC chemokine ligand 16,CXCL16)屬于趨化因子家族成員，在正常早孕期女性的滋養(yǎng)細(xì)胞中呈高表達(dá)，其唯一受體為蛻膜免疫細(xì)胞CXCR16，二者相互作用為胚胎的發(fā)育提供保障。近期有研究表明，CXCL16通過對巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)，使巨噬細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞，M2型巨噬細(xì)胞可調(diào)整Th1型細(xì)胞中IL-15的數(shù)量而發(fā)揮對NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)，使NK細(xì)胞活性達(dá)到最適宜妊娠的程度[22-23]。CXCL12及CXCR4也是影響NK細(xì)胞活性的一組趨化因子及其受體。有研究報道，RSA女性滋養(yǎng)細(xì)胞CXCL12和CXCR4表達(dá)水平降低，使滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖分化嚴(yán)重受阻，dNKs中維持正常妊娠的CD56brightCD16-分型募集失敗，發(fā)揮細(xì)胞毒性的CD56dimCD16+分型占絕大多數(shù)[21]，胎盤發(fā)育與動脈血管的重塑過程受阻，因而無法維持正常妊娠。除上述2類趨化因子，CC亞組CCL2水平也可預(yù)測RSA的發(fā)生[24]，其機(jī)制可能與CCL2上調(diào)一種細(xì)胞因子信號抑制因子而抑制NK細(xì)胞殺傷活性有關(guān)[25]。

4.4 巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)MIF由巨噬細(xì)胞分泌，能夠抑制巨噬細(xì)胞的移動，參與機(jī)體免疫反應(yīng)。妊娠需要各種免疫因子的調(diào)節(jié)，MIF在促進(jìn)胎盤血管發(fā)育、維持母胎界面的正常免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。李岐佩等[26]研究發(fā)現(xiàn)，有2次及2次以上自然流產(chǎn)史的女性患者M(jìn)IF水平顯著低于正常育齡期女性?；贛IF功能，推測因MIF在RSA女性體內(nèi)的減少導(dǎo)致其抑制巨噬細(xì)胞的作用減弱，使巨噬細(xì)胞分泌各種抑制性細(xì)胞因子減少，進(jìn)而使妊娠期包括NK細(xì)胞在內(nèi)的主要免疫細(xì)胞活性過強(qiáng)，妊娠過程受到免疫排斥，導(dǎo)致胚胎死亡。

5 NK細(xì)胞活性與RSA

目前已有充足證據(jù)表明，NK細(xì)胞活性異常與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生密切相關(guān)[27-28]，其機(jī)制包括2個方面：一方面是NK細(xì)胞功能亢進(jìn)，殺傷活性增強(qiáng)，導(dǎo)致NK細(xì)胞過多分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，引起機(jī)體免疫功能紊亂，超出免疫耐受范圍，使NK細(xì)胞攻擊自身細(xì)胞甚至胚胎而導(dǎo)致RSA。目前，有利于妊娠的NK細(xì)胞的活性范圍尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，臨床中應(yīng)結(jié)合病史、輔助檢查等對免疫性RSA進(jìn)行綜合診斷。另一方面是NK細(xì)胞活性不足可導(dǎo)致螺旋動脈重塑紊亂以及滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，胎盤無法供應(yīng)足夠的血流及營養(yǎng)，造成胚胎停育。pNKs可產(chǎn)生趨化因子與分泌因子，促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，有利于將更多的氧氣與營養(yǎng)運(yùn)輸?shù)教ケP[3]。此外，妊娠女性子宮內(nèi)保持適當(dāng)數(shù)量的NK細(xì)胞可減少微生物感染[29]。綜上，只有NK細(xì)胞活性在妊娠時期母胎界面處于一種免疫平衡狀態(tài)，發(fā)揮適當(dāng)?shù)拿庖呋钚?，才能保護(hù)胚胎，防止流產(chǎn)的發(fā)生。

6 總結(jié)與展望

人體的免疫系統(tǒng)龐大而復(fù)雜，任何一類分子的變化可直接或間接影響另一類分子的功能。NK細(xì)胞的受體、配體以及相關(guān)免疫細(xì)胞和趨化因子應(yīng)在體內(nèi)保持動態(tài)平衡，既不能過度抑制，亦要合理控制活性程度，否則將會導(dǎo)致機(jī)體的免疫失衡。在妊娠期這種免疫失衡可導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。NK細(xì)胞的受體、配體以及相關(guān)免疫細(xì)胞和趨化因子等分子可為RSA預(yù)后的判斷以及免疫治療療效的評判標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考價值。然而，僅有少數(shù)較成熟的研究成果，多數(shù)研究結(jié)論還有待今后進(jìn)一步的驗(yàn)證。