黃凌佳 楊舒奇 孫欣 黃明莉

胚胎停育的定義為早孕期(妊娠12周以內(nèi))的胚胎丟失或胎兒停止發(fā)育的病理過程，影像學診斷提示空孕囊或無胎心的胎兒。隨育齡期婦女中發(fā)病率的逐年增高，探討胚胎停育原因的研究也在不斷發(fā)展及細化。隨著分子生物學的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育組織中存在細胞過度凋亡和胎盤血管增殖不良[1]，以及免疫調(diào)節(jié)過度的現(xiàn)象。各種各樣參與不同途徑的分子標記物被用于胚胎停育妊娠組織的研究，本文總結(jié)了近十年研究熱點的標記物，按作用機制分析，從滋養(yǎng)細胞異常侵入與黏附、胎盤及絨毛血管生成、調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞過度凋亡、細胞免疫調(diào)節(jié)機制、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化這五個方面分別介紹這些分子標記物具體的作用途徑，探究胚胎停育具體的發(fā)病機制。

一、滋養(yǎng)細胞異常侵入與黏附

1. 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類結(jié)構(gòu)中含有Zn2+、Ca2+的蛋白酶[1]，能夠特異性降解細胞外基質(zhì)及基底膜。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)作為其特異的抑制劑，通過與有活性的MMPs中高度保守的Zn2+結(jié)合位點結(jié)合，抑制MMPs作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)胚胎停育患者蛻膜組織中，MMP-2及MMP-9的表達水平明顯高于對照組，TIMP-1作為MMP-9的特異性抑制劑，其表達水平明顯低于對照組。在胚胎植入及胎盤形成過程中，子宮內(nèi)膜細胞外基質(zhì)的適當降解和滋養(yǎng)細胞侵入內(nèi)膜之間的某種平衡狀態(tài)能夠保證胚胎成功著床和發(fā)育[4]。在孕6～8周，MMP-2是滋養(yǎng)細胞侵入作用的主要蛋白酶，在孕9～12周，MMP-2及MMP-9同時對滋養(yǎng)細胞侵入起作用。在早期滋養(yǎng)細胞侵入和子宮螺旋動脈重塑過程中，這些蛋白酶水解蛻膜基質(zhì)及基底膜，為胚胎絨毛外滋養(yǎng)細胞的侵蝕消除物理屏障[1]。同時研究表明，MMP-2、TIMP-1及TIMP-2對血管建立有重要作用，胚胎停育組織的絨毛和蛻膜中TIMP-1表達明顯下降，母胎界面不能形成正常妊娠需要的低阻力血管，使滋養(yǎng)層功能不良，胚胎缺乏血氧供應(yīng)，同時MMP-2及MMP-9表達上調(diào)，造成滋養(yǎng)細胞異常侵入，導致胚胎停育[5-6]。

2. E-鈣粘連蛋白(E-Cadherin，E-cad)是一種鈣依賴黏附分子，廣泛表達于上皮細胞，主要功能介導特定組織和器官同型細胞間的黏附作用，維持上皮細胞的完整性和極性[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，E-cad參與胚胎正常發(fā)育、組織形成和滋養(yǎng)細胞的侵蝕活動，妊娠早期滋養(yǎng)細胞表面均有E-cad的黏附與表達，這樣有利于胚泡的黏附與植入[8-9]。E-cad水平表達的高低可以有效反映滋養(yǎng)細胞的浸潤能力。有研究用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在胚胎停育蛻膜組織中E-cad在mRNA水平表達增加，子宮內(nèi)膜從增殖期到分泌期過渡時，子宮內(nèi)膜腺上皮細胞表達E-cad水平逐漸增加，而分泌期過渡到蛻膜期，E-cad表達水平則下降[8]。當滋養(yǎng)細胞需要進一步與子宮內(nèi)膜相容時，上皮細胞表達的E-cad降低，使子宮內(nèi)膜腺上皮細胞相互粘附力降低，有利于滋養(yǎng)細胞入侵。研究證實，在胚胎停育患者的絨毛組織中E-cad的高表達，影響滋養(yǎng)細胞與子宮內(nèi)膜的兼容性，無法形成胚胎正常發(fā)育的微環(huán)境，同時阻礙絨毛血管的重鑄，造成胎盤淺著床，從而導致胚胎停育的發(fā)生。有國外學者提出，E-cad的正常表達受SLIT/Roundout(Robot)信號的調(diào)節(jié)[10]，同時SLIT2/Roundout1(Robot)的單鏈化可能引導滋養(yǎng)細胞的遷移及浸潤。隨著妊娠的進展，E-cad在各絨毛部位表達有所下降，這有助于滋養(yǎng)細胞的侵入，保證滋養(yǎng)細胞層的正常生理功能，維持胚胎的正常發(fā)育。

二、胎盤及絨毛血管生成

胚胎及胎兒的生長發(fā)育與胎盤絨毛血管發(fā)育關(guān)系密切，而胎盤絨毛血管的形成過程實際上就是血管內(nèi)皮細胞的生長發(fā)育過程，本文總結(jié)了以下兩個熱門研究的分子標記物。

1. miR-126(MicroRNA-126)基因組:miR-126(MicroRNA-126)基因組定位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(epidermal growth factor-likedomain7,EGFL7)基因的第七個內(nèi)含子中，EGFL7本身就是血管內(nèi)皮特異性表達的基因，因而兩者共同對血管的形成、發(fā)育及功能起調(diào)控作用[11]。Sehmid等研究將小鼠的EGFL7基因敲除后部分胚胎死于血管發(fā)育異常及異常的胚胎干細胞聚集[12]。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是miR-126的預測靶基因之一，miR-126與VEGF在胚胎正常發(fā)生、發(fā)展過程中起正向調(diào)節(jié)作用，miR-126在正常妊娠時可以通過抑制Spred1基因，提高內(nèi)皮細胞對VEGF和成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的敏感性，參與胚胎血管的新生并維持血管的完整性[13]。在針對研究 miR-126 在肺癌中的表達發(fā)現(xiàn)，上調(diào) miR-126 可以明顯抑制 VEGF 的表達，對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起抑制作用。國內(nèi)學者針對 miR-126 與 VEGF 的表達進行相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)兩者在胚胎停育組中呈負相關(guān)，提示 miR-126 與 VEGF 在胚胎停育的發(fā)生、發(fā)展中有負向調(diào)節(jié)作用，miR-126可能直接抑制VEGF基因的表達，從而使胚胎血管發(fā)育減少或功能異常[13]。

2. VEGF是一類具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原，是血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子[14]，形態(tài)學分析提出VEGF的表達區(qū)域正是絨毛血管形成區(qū)域，它操控了胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的完整建立。其中VEGFR屬于酪氨酸激酶受體，分布于血管內(nèi)皮細胞上，有VEGFR1及VEGFR2及VEGFR3三個受體，其中VEGFR2發(fā)揮主要作用，學者們對VEGF的深入研究后發(fā)現(xiàn)，VEGF表達下降會削弱內(nèi)皮細胞侵襲、遷移及增殖功能，使血管通透性相關(guān)活性因子表達下降，導致絨毛及蛻膜血管生成減少，絨毛滋養(yǎng)細胞植入過淺，胎盤血管網(wǎng)路建立不完善，影響母胎間血流供應(yīng)及物質(zhì)交換，最終導致胚胎停育的發(fā)生[13]。國外學者對母體螺旋動脈重塑及滋養(yǎng)細胞侵入的過程研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導因子α(hypoxia inducible factor-1，HIF1)/VEGF與絨毛血管生成之間存在正相關(guān)關(guān)系，HIF1α/VEGF在調(diào)節(jié)絨毛血管生成有重要作用[15]，已知HIF1調(diào)節(jié)細胞適應(yīng)低氧狀態(tài)，穩(wěn)定的HIF1與細胞核結(jié)合，并與多個靶基因(比如VEGF)的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，參與調(diào)節(jié)血管生成。實驗發(fā)現(xiàn)人滋養(yǎng)細胞中HIF1信號的丟失與流產(chǎn)有關(guān)[15]。本文推測胎盤血管的發(fā)育可能是通過激活HIF1α信號通路及其靶點VEGF來實現(xiàn)。

三、滋養(yǎng)細胞過度凋亡

1. 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)是一類蛋白酶家族。Caspase家族在細胞凋亡途徑中起主要作用，是啟動和執(zhí)行細胞凋亡關(guān)鍵的凋亡蛋白[16]。起細胞凋亡執(zhí)行者作用的是caspase3,6,7。研究證實，正常妊娠早期滋養(yǎng)細胞存在凋亡現(xiàn)象，而滋養(yǎng)細胞的增殖與凋亡處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)。針對胚胎停育的絨毛和蛻膜組織研究發(fā)現(xiàn)，胚胎停育組織中Caspase-3 RNA和蛋白表達較對照組顯著升高，提示胚胎停育的發(fā)生機制可能是細胞增殖與細胞凋亡比例失衡[17]。Caspase-3 RNA和蛋白在胚胎停育組織的高表達，可能啟動了線粒體/細胞色素C介導的細胞凋亡途徑，導致細胞滋養(yǎng)層和胎盤滋養(yǎng)層中的細胞凋亡比例增高，大量凋亡的滋養(yǎng)細胞使滋養(yǎng)細胞層正常功能受損，阻礙胚胎正常生長發(fā)育，造成胚胎停育[18]。

2. 研究發(fā)現(xiàn)大量的微RNA(MicroRNA)對胎盤的發(fā)育和功能起著重要作用[19]。據(jù)報道，正常妊娠有一定程度的滋養(yǎng)細胞凋亡，是一種正常的生理現(xiàn)象，這有利于絨毛和絨毛分支的形成與發(fā)育，然而當滋養(yǎng)細胞過度凋亡時，會導致絨毛發(fā)育不良或者滋養(yǎng)細胞變性[20]，高水平的凋亡可能是導致胚胎停育的主要原因[21-22]。實驗證明，在miR-575的模擬實驗組中，p53基因表達上調(diào)，當用miR-575抑制劑轉(zhuǎn)染實驗組人絨毛膜癌細胞后，p53基因的表達明顯下降，細胞凋亡率明顯下降，提示miR-575可能通過調(diào)節(jié)絨毛細胞凋亡維持胚胎的正常發(fā)育。同時實驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-575抑制劑轉(zhuǎn)染細胞組的B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)蛋白的表達也顯著降低，進一步表明miR-575在絨毛細胞中的凋亡作用[23]。成功的妊娠不僅取決于細胞的凋亡，還取決于足夠的絨毛血管生成，能夠為胚胎提供足夠的氧氣和營養(yǎng)[24]。有學者研究miR-575與絨毛血管生成的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-575的過度表達顯著降低了VEGF和人類血管生成素-2(Human Angiopoietin 2，Ang-2)的表達，用miR-575抑制劑轉(zhuǎn)染的細胞組，VEGF/Ang-2的表達水平明顯升高，表明了miR-575在絨毛血管中也起到了調(diào)節(jié)作用[19]。因此，我們總結(jié)miR-575不僅可以作為胚胎停育的生物標記物，也可以作為未來預防性治療胚胎停育的潛在分子靶點。

四、細胞免疫調(diào)節(jié)機制

TIPE是腫瘤壞死因子-α誘導蛋白8[25-29]家族中的一員，是一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子[25]，其中TIPE2是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫抑制劑，在炎癥和免疫維持中表現(xiàn)出負調(diào)節(jié)作用[30]。Sun的Westernblot實驗結(jié)果表明TIPE2陽性染色主要存在于蛻膜腺上皮細胞的細胞質(zhì)、蛻膜血管的內(nèi)皮細胞及基質(zhì)細胞中，而且TIPE2蛋白在流產(chǎn)及胚胎停育患者的蛻膜組織中表達明顯下調(diào)[25]，有學者進一步分析TIPE2與免疫因子TNF-α、IL-10的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TIPE2與IL-10的表達成正相關(guān)，TIPE2可以通過下調(diào)促炎細胞因子和炎癥細胞的有絲分裂來抑制炎癥細胞的活化。對于妊娠這一生理過程來說，巨噬細胞M2極化也是人類早期妊娠成功的重要因素[31]。有報道提出，TIPE2蛋白通過激活PI3K-AKT信號通路促進巨噬細胞M2的分化[32]，從而維持妊娠。所以TIPE2在維持母胎免疫耐受性方面起著重要作用，在母胎免疫耐受的機制中，可以下調(diào)促炎細胞因子的過度表達及炎癥細胞的有絲分裂，降低母體免疫系統(tǒng)對胎兒的過度免疫識別及應(yīng)答，從而保證胚胎的良好發(fā)育。同時有學者提出，TIPE2可以抑制各種癌細胞的侵襲[33]，早期胚胎的著床和胎盤的形成建立在滋養(yǎng)細胞成功侵入母體子宮內(nèi)膜的基礎(chǔ)之上，一旦滋養(yǎng)細胞侵入過強，導致蛻膜組織中的膠原過度水解，使蛻膜組織壞死脫落，從而導致胚胎停育的發(fā)生。TIPE2在這一過程中可以抑制滋養(yǎng)細胞的過度侵襲，維持蛻膜組織的正常形態(tài)和生理功能，從而維持胚胎正常發(fā)育，但滋養(yǎng)細胞的侵襲具有局限性，具體機制有待進一步研究驗證。

五、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化

妊娠是一個非常復雜卻又精細的生理過程，卵子被排出后，增殖期的子宮內(nèi)膜在雌孕激素的共同作用下轉(zhuǎn)化為分泌期子宮內(nèi)膜，這就是蛻膜化的過程。這是胚胎植入與正常發(fā)育的基礎(chǔ)條件。蛻膜化是一個需要多種細胞因子、激素及免疫細胞、信號轉(zhuǎn)導分子共同參與的過程[34]。

1. 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是誘導骨生長的重要因子，研究發(fā)現(xiàn)黃體來源的黃體酮(P4)可能通過Ihh-Nr2f2-Bmp2信號軸作用于Bmp2的下游因子Wnt4進而激活Wnt信號通路來調(diào)控蛻膜化的過程。泌乳素(prolactin,PRL)是子宮內(nèi)膜蛻膜化的公認標記分子，P4可以促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞分泌PRL，PRL可以正向促進黃體酮及其受體表達，加強上述信號通路作用。實驗證明Bmp2在正常早孕蛻膜組織表達強陽性，在胚胎停育蛻膜組織中表達弱陽性及陰性，正常早孕蛻膜細胞的PRL表達明顯高于胚胎停育組織。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜蛻膜化的孕激素信號中Bmp2是重要的調(diào)控因子，條件敲除雌鼠Bmp2基因，雌鼠會因蛻膜化失敗而導致不孕，人Bmp2重組蛋白可以顯著增強體外誘導蛻膜化反應(yīng)[35]。因此推測Bmp2可作為子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)中重要的調(diào)控因子。

2. 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1(Insulin like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)作為子宮內(nèi)膜蛻膜化的重要參與者，可與胰島素樣生長因子、胰島素、卵巢激素、細胞因子等共同參與調(diào)控胚胎種植和胎兒生長。蛻膜化IGFBP-1濃度過高造成子宮內(nèi)膜容受性下降，胚胎種植障礙進而導致流產(chǎn)發(fā)生，IGFBP-1表達降低還與胎盤形成不良有關(guān)[36]。

綜上所述，胚胎的正常發(fā)育是一個復雜而精密的過程。子宮內(nèi)膜正常蛻膜化，滋養(yǎng)細胞的絨毛及蛻膜血管網(wǎng)絡(luò)的建立，母胎免疫機制等這些過程都是胚胎正常發(fā)育必須經(jīng)歷的環(huán)節(jié)。在這個過程中，每一個環(huán)節(jié)都不是孤立的，眾多分子水平標記物將一個個環(huán)節(jié)緊密銜接起來，協(xié)同完成一個完整的妊娠過程。本文總結(jié)了上述目前作為研究重點的分子標記物，希望為胚胎停育發(fā)病機制的進一步研究提供幫助和思路。