羅嬌 盧玲 羅竹林 張曉英 曹煜

【摘要】目的 研究珊瑚姜油（Zingiber corallinum oil，ZCO）對人黑色素瘤WM35細胞增殖及凋亡的影響，并探討其作用機制。方法 不同濃度（2.5-40mg/L）ZCO體外作用于人黑素瘤WM35細胞。采用CCK-8法檢測細胞活力; 免疫熒光染色觀察細胞形態(tài)變化;比色法測Caspase-3酶活性;RT-qPCR檢測Bax/BcL-2 表達水平;流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期。結果 ZCO以時間-劑量依賴性方式抑制黑素瘤WM35細胞株增殖，鏡下可見典型細胞凋亡形態(tài)，Caspase-3酶活性呈劑量依賴性增加。隨著ZCO藥物濃度增加，Bax mRNA表達上調，而BcL-2 mRNA表達下調，細胞周期被阻滯在G1期，G2/M期及S期細胞數(shù)減少。結論 ZCO對人黑素瘤WM35細胞增殖具有抑制作用，其機制可能與上調Bax及下調BcL-2表達有關，并使細胞周期阻滯在G1期，同時，Caspase-3作為凋亡途徑的終末關鍵酶也參與其中。

【關鍵詞】珊瑚姜油;WM35;增殖;凋亡

【中圖分類號】R453? ?【文獻標識碼】A? ?【文章編號】2026-5328（2021）07-009-03

黑色素瘤（melanoma）又稱為惡性黑色素瘤，是一種能產生黑色素的高度惡性腫瘤，其特點為惡性程度高，轉移發(fā)生早，死亡率高[1]。近年來，黑素瘤發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但目前的治療方法在提高病人的生存率上作用有限。珊瑚姜是中國的傳統(tǒng)苗藥之一，通過超臨界二氧化碳法從珊瑚姜中提取ZCO，近幾年研究顯示，ZCO具有抗細菌、真菌、殺蟲、抗氧化等活性[2，3]。吳春維等人發(fā)現(xiàn)ZCO對HeLa細胞具有抑制其增殖并促凋亡作用，但是ZCO是否會影響黑素瘤WM35細胞的增殖和凋亡仍不清楚。本實驗主要研究ZCO對WM35細胞增殖的抑制及凋亡的影響，探討其作用機制，為ZCO治療人黑色素瘤提供實驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料及試劑? ZCO（貴陽舒美達藥廠）DMSO溶解后過濾除菌備用;WM35細胞（上海一研生物科技有限公司），CCK-8（日本同仁化學）、青鏈霉素雙抗、RPMI1640（貴州泰思騰生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒及周期試劑盒（上海貝博生物），caspase-3檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），Bax/BcL-2引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)? WM35細胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗）， 置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25 %胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2細胞毒性檢測? 離心收集對數(shù)生長期細胞，參考涂云華等人方法[4]，調整細胞密度為1.2×105個/ml后接種于96孔板，0.05ml/孔，培養(yǎng)24h后，實驗組加入ZCO，補足培養(yǎng)基至總體積為0.1ml/孔，使藥物終濃度分別為2.5、5、10、20、40mg/L;設對照組，每一濃度均設6個復孔，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h，培養(yǎng)結束的1.5h前，每孔加入10L CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，酶標儀測定波長為450nm時吸光度（OD）值。

1.2.3細胞形態(tài)觀察? 調整細胞密度為1.1×104個/ml，接種至6孔板，培養(yǎng)12小時后，加入ZCO，使其終濃度為2.5、10、40mg/L，設空白對照，培養(yǎng)48h后，經過AO/EB染色，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.2.4Caspase-3酶活性? 離心收集細胞，每兩百萬細胞加入50ul裂解液的比例加入裂解液，12000g離心15min，吸取上清，按試劑盒步驟加入試劑，37℃孵育4h，酶標儀檢測（波長為405nm）吸光度。Caspase-3活化程度=實驗組A405/正常對照A405。

1.2.5RT-PCR測Bcl-2/Bax mRNA表達水平? Trizol提取WM35細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，實驗方法參考涂云華等人[12]。引物設計：Bax（sense5'-TCAGGATGCGTCCACCAAGAA -3'，antisense5'-TGTCCACGGCGGCAATCA -3'）及BcL-2（sense5'-ATGGGATCGTTGCCTTATGC -3'，antisense5'-TCAGTCTACTTCCTCTGTGGATGTTG -3'），內參：GAPDH（sense5'-TGGACCTGACCTGCCGT-3'，antisense5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'），按照SYBR Green/ROX qPCR Master Mix步驟操作。反應條件： ①BcL-2： 95℃預變性10min， 95℃變性15s，60℃退火30s， 72℃ 延伸30s， 40個循環(huán)， 最后延伸72℃10min;②Bax： 58℃退火。計算值=2-[（藥物組目的基因CT值-藥物組管家基因CT值）-（細胞對照組目的基因CT值-細胞對照組管家基因CT值）]。

1.2.6細胞凋亡及周期檢測? 取對數(shù)生長期細胞，調整細胞密度為1.5×105/ml，藥物濃度設置同1.2.3，培養(yǎng)48h后，調整細胞密度為2.5×106/ml，參考Wu J等人實驗方法[5]，細胞固定，AnnexinV-FITC/PI染色后按周期試劑盒染色，BD FACSCalibur流式細胞儀測定細胞凋亡及周期。

1.3統(tǒng)計學處理? 采用Graphpad prism 7.0進行統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1細胞毒性檢測? 隨著ZCO濃度增加，WM35細胞OD值逐漸降低，其作用方式呈時間-劑量依賴性，尤其對培養(yǎng)48h的WM35細胞增殖速度減慢最為明顯。

2.2細胞形態(tài)? 正常黑素瘤WM35細胞貼壁生長，呈多角形及不規(guī)則形（如圖A）。ZCO處理后，細胞生長變慢，胞質間隙增大;AO/EB染色后，隨濃度升高，黃綠色熒光逐漸減少，而紅色熒光逐漸增多，細胞變成圓形或橢圓形;可見數(shù)量不等的漂浮細胞及細胞碎片（如圖B、C、D）。

A正常對照組;B，C，D分別為2.5、10、40mg/L的ZCO處理WM35細胞（×100）

2.3 Caspase-3酶活性? 運用0-40mg/L的ZCO作用于WM35細胞，結果顯示：隨著藥物濃度增加，Caspase-3酶活性隨之增強，當藥物濃度達到40mg/L時，酶活性達到最大（p<0.05）。

2.4Bax/BcL-2 mRNA表達? 低濃度至高濃度ZCO作用WM35細胞48h，Bax/BcL-2 mRNA比值升高，其作用方式呈劑量依賴性。

* vs對照組，P<0.05

2.5細胞凋亡? ZCO作用WM35細胞48h后，細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，由低濃度至高濃度，凋亡逐漸增加，尤其以早期凋亡較為明顯。

A為對照組，B、C、D藥物濃度分別為2.5、10、40mg/L

2.6細胞周期變化? ZCO作用WM35細胞48h，隨藥物濃度增加，G2期細胞逐漸減少，細胞被阻滯在G2期。

3 討論

珊瑚姜可作藥和食兩用，具有廣泛的藥理活性，且毒性小等優(yōu)點，在治療腫瘤方面的研究報道較少。

本實驗采用不同劑量的ZCO作用于WM35細胞，結果顯示， ZCO對WM35細胞的生長具有抑制作用， 隨著藥物濃度的增加， 抑制作用明顯增強，呈現(xiàn)時間-劑量依賴性，且當藥物作用48h，抑制作用最為明顯。吖啶橙透過正常細胞膜，使細胞核呈綠色或黃綠色熒光，其使凋亡細胞染上致密濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒;而壞死細胞黃色熒光減弱甚至消失[6]。本實驗中，ZCO由低濃度至高濃度，黃綠色熒光逐漸減少，而紅色熒光逐漸增多，細胞呈圓形或橢圓形，可見數(shù)量不等的漂浮細胞與細胞碎片。流式細胞儀檢測結果顯示，隨藥物濃度增加凋亡程度逐漸明顯。

Caspase-3最主要的底物是多聚聚合酶PARP（poly（ADP-ribose） polymerase），該酶與DNA修復、基因完整性監(jiān)護有關[7]。在細胞凋亡啟動時，116kD的PARP在Asp216-Gly217之間被Caspase-3剪切成31kD和85kD兩個片段，使PARP中與DNA結合的兩個鋅指結構與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能[8]。本實驗結果顯示，隨著藥物濃度增加，Caspase-3酶活性逐漸增強，呈時間-劑量依耐性，從而證實了Caspase-3參與ZCO誘導細胞凋亡過程。

細胞凋亡的兩個進化保守信號轉導途徑中，BcL-2家族成員的構成比例是凋亡調控的關鍵因素，尤其是BcL-2/Bax比率是啟動細胞凋亡的“分子開關”[9]。本實驗中，隨著藥物濃度增加， Bax/BcL-2的比值逐漸增加，說明ZCO通過使凋亡相關基因Bax表達上調，使BcL-2表達下調而使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。

細胞周期是指從一次細胞分裂形成子細胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞為止所經歷的過程，分為間期與分裂期兩個階段，間期又分為三期即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期），當細胞周期發(fā)生紊亂時，細胞出現(xiàn)惡性增殖，導致腫瘤的發(fā)生。本實驗顯示，隨著ZCO濃度增加，G2期細胞數(shù)減少，細胞周期阻滯在G2期，防止其向G2/M期轉換，阻斷了細胞的有絲分裂，從而對WM35細胞起到增殖抑制作用。

總之， ZCO可抑制WM35細胞增殖，其機制是通過激活凋亡途徑關鍵酶，使凋亡相關基因Bax表達上調，Bcl-2表達下調，細胞周期阻滯在G2期，最終阻止腫瘤細胞的增殖與分化。

參考文獻：

[1] Lens M B， Dawes M. Global perspectives of contemporary epidemiological trends of cutaneous malignant melanoma[J]. British Journal of Dermatology，2004，150（2）：179-185.

[2] Dank G， Rassnick K M， Sokolovsky Y， et al. Use of adjuvant carboplatin for treatment of dogs with oral malignant melanoma following surgical excision.[J]. Veterinary & Comparative Oncology，2014，12（1）：78-84.

[3] Yang Z， Luo S， Peng Q， et al. GC-MS Analysis of the Essential Oil of Coral Ginger （Zingiber corallinum Hance） Rrhizome Obtained by Supercritical Fluid Extraction and Steam Distillation Extraction[J]. Chromatographia，2009，69（7-8）：785-790.

[4] 涂云華，康穎倩，周英，等. 姜黃揮發(fā)油對THP-1細胞增殖及凋亡的影響[J]. 山東大學學報（醫(yī)學版），2015，05期（5）：46-51.

[5] Wu J， Nie X. Effect of Oxymatrine on Cell Proliferation，Apoptosis，Cell Cycle and ERK1 Expression of the Fibroblasts Derived from Hypertrophic Scar and Keloids[J]. Chinese Journal of Minimally Invasive Surgery，2011，11（3）：259-263.

[6] Cao X， Wang A H， Jiao R Z， et al. Surfactin Induces Apoptosis and G2/M Arrest in Human Breast Cancer MCF-7 Cells Through Cell Cycle Factor Regulation[J]. Cell Biochemistry &amp; Biophysics，2009，55（3）：163-171.

[7] Pierre Olivier H， Rapha?l D， Christiane D， et al. Ursolic acid induces apoptosis through mitochondrial intrinsic pathway and caspase-3 activation in M4Beu melanoma cells[J]. International Journal of Cancer，2005，114（1）：1-11.

[8] Fossey S L， Bear M D， Lin J， et al. The novel curcumin analog FLLL32 decreases STAT3 DNA binding activity and expression， and induces apoptosis in osteosarcoma cell lines[J]. Bmc Cancer，2011，11（7）：1240.

[9] 王衛(wèi)東，陳正堂. Bcl-2/Bax比率與細胞“命運”[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2007，04期：393-396.

基金項目：貴陽市科技局科技創(chuàng)新平臺項目[筑科合同（2012303）號];

作者簡介：羅嬌（1988-），女，碩士研究生，主管藥師，藥物的基礎研究及合理運用。