古麗娜·卡里曼江，阿布都艾則孜·艾爾肯，阿麗亞·依拉木，美麗萬·阿不都熱依木，木巴拉克·伊明江

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊830000)

類風濕性關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性、炎性、進行性、侵襲性及系統(tǒng)性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病[1]?？癸L濕中草藥傳統(tǒng)劑型存在生物利用度低、劑量大、起效慢、用藥不方便等不足。中藥凝膠劑是近年來的新興劑型,作為中醫(yī)藥內(nèi)病外治法的良好劑型用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。

刺山柑(CapparisspinosaL.)為白花菜科山柑屬藤本植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤[2]，具有祛風散寒、除濕、鎮(zhèn)痛、消腫的功效[3]。刺山柑化學(xué)成分復(fù)雜，楊麗等[4]以刺山柑果凝膠膏劑的有效成分蘆丁為指標物質(zhì)，對促透劑進行了篩選。

作者所在課題組前期確定了刺山柑凝膠劑處方及制備工藝，但未對促透劑進行篩選。而透皮吸收的指標參數(shù)豐富并具有模糊特征，不能依據(jù)某單一指標進行評價。熵權(quán)法是一種客觀的體系權(quán)重的計算方法，可有效降低主觀隨意性對權(quán)重值的干擾，提高權(quán)重的準確度[5]。模糊綜合評價法將指標數(shù)值與隸屬度對應(yīng),用隸屬度來反映指標的好壞,能夠有效解決由系統(tǒng)本身狀態(tài)的模糊性和內(nèi)部的復(fù)雜性所帶來的難以準確評價的問題,具有結(jié)果清晰、系統(tǒng)性強的特點[6]。在前期刺山柑凝膠劑劑型研究的基礎(chǔ)上，作者分別選擇氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸作為促透劑，以穩(wěn)態(tài)流量(Jss)、滲透系數(shù)(Kp)、滯后時間(Tlag)、增滲倍數(shù)(ER)、皮膚殘留量(Qs)為評價指標，采用熵權(quán)模糊綜合評判模型研究不同促透劑及其用量對刺山柑凝膠劑中有效成分蘆丁透皮吸收特征的影響，以期獲得具有最佳促透效果的促透劑，為提高刺山柑凝膠劑的藥效發(fā)揮奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

刺山柑藥材，購于百草堂中藥房，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院美麗萬·阿不都熱依木教授鑒定為白花菜科山柑屬。

蘆丁標準品(批號111G022，質(zhì)量分數(shù)≥98%)，北京索萊寶科技有限公司；氮酮(批號C11290675)、油酸(批號C10615044)、丙二醇(批號C11276571)、薄荷醇(批號C11169169)，上海麥克林生化科技有限公司；其它試劑均為市售分析純。

高效液相色譜儀，Agilent；TP-6型智能透皮試驗儀、改良型Franz立式擴散池，天津鑫州科技有限公司；電子分析天平，深圳無限量衡器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

1.2 動物

SPF級SD雄性大鼠[質(zhì)量合格證號SCXK(新)2018-0002]，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.3 刺山柑凝膠劑的制備

稱取適量卡波姆940，加甘油調(diào)成糊狀，再加入刺山柑果實濃縮液，攪勻，加適量蒸餾水溶脹，靜置過夜，備用。將無水乙醇、促透劑、增溶劑、防腐劑加入凝膠中，充分攪拌后滴加三乙醇胺，調(diào)節(jié)pH值至6～7，即得刺山柑凝膠劑[7]。

1.4 體外透皮實驗

1.4.1 動物離體皮膚的制備

將大鼠脫臼處死后，刮去腹部的毛，剪下腹部皮膚，仔細剔除皮下脂肪和粘連物，用生理鹽水清洗干凈，剪成適當大小，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用前自然解凍，并檢查大鼠皮膚的完整性，確保無任何破損。

1.4.2 接收液的篩選

分別用生理鹽水、10%乙醇-生理鹽水、20%乙醇-生理鹽水、磷酸緩沖液(pH值7.4，下同)、10%乙醇-磷酸緩沖液、20%乙醇-磷酸緩沖液溶解已知量的蘆丁，進樣分析。結(jié)果顯示，采用20%乙醇-磷酸緩沖液溶解蘆丁，溶解度可達85.2%。故以20%乙醇-磷酸緩沖液作為接收液。

1.4.3 含不同促透劑的刺山柑凝膠劑的制備

分別以氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸為促透劑，制備含不同促透劑的刺山柑凝膠劑，以不含促透劑的刺山柑凝膠劑(F0)作為對照，處方見表1。

表1 含不同促透劑的刺山柑凝膠劑處方

1.4.4 藥物累積滲透量的測定

將大鼠皮膚自然固定在改良型Franz立式擴散池的供應(yīng)室和接收室(提前加入轉(zhuǎn)子)之間，有效擴散面積為1.8 cm2，角質(zhì)層面向供應(yīng)室，上下夾緊后在供應(yīng)室中加入刺山柑凝膠劑1.0 g，均勻涂抹于皮膚表面，向接收室內(nèi)注入預(yù)熱過的20%乙醇-磷酸緩沖液作為接收液，確保液面與皮膚接觸無氣泡，設(shè)置透皮試驗儀溫度為(37.0±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速為(300±1) r·min-1，分別于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h抽取接收液3.0 mL，同時補加等溫等體積的新鮮接收液。將接收液用氮氣吹干后加入甲醇溶解，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后采用HPLC法測定，按式(1)計算藥物單位面積累積滲透量(Q，μg·cm-2)：

(1)

式中：cn、ci分別為n、i時間點的藥物質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V為接收液體積,mL；Vi為取樣量,mL；S為擴散滲透面積,cm2。

1.5 藥物儲庫效應(yīng)實驗

當體外透皮實驗完成后，從供應(yīng)室中取出刺山柑凝膠劑,從改良型Franz立式擴散池中取出大鼠皮膚，用接收液清洗大鼠皮膚表面，去除殘留藥物，再用濾紙吸干。將大鼠皮膚用手術(shù)剪刀剪成碎片，用研缽進一步研磨。將研磨好的皮膚組織放入離心管中，加入3.0 mL接收液，渦旋勻漿5 min，再常溫超聲處理30 min后于3 000 r·min-1離心5 min。收集上清液,氮氣吹干溶劑，再用甲醇溶解，采用HPLC法測定藥物的皮膚殘留量(Qs，μg·cm-2)。

1.6 刺山柑凝膠劑中蘆丁含量的測定

1.6.1 溶液的制備

蘆丁標準溶液：精密稱取蘆丁標準品0.002 0 g于5 mL棕色容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，即得0.4 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。

供試溶液：取各時間點的透皮接收液，將接收液用氮氣吹干后，加入甲醇溶解，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.6.2 色譜條件

島津ODS-2 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.2%磷酸水溶液-乙腈(80∶20，體積比)；流速1 mL·min-1；檢測波長360 nm；進樣量20 μL；柱溫25 ℃?？瞻捉邮找?、蘆丁標準溶液、供試溶液的HPLC圖譜見圖1。

圖1 空白接收液(a)、蘆丁標準溶液(b)、供試溶液(c)的HPLC圖譜

1.7 熵權(quán)模糊綜合評判模型綜合評價

1.7.1 評價對象集、因素集和評語集的確定

依據(jù)促透劑評價指標和種類[8-9]，設(shè)置對象集=(促透劑促透能力)，因素集=(Jss、Kp、ER、Tlag)，評語集=(優(yōu)、良、中、一般、差)。

1.7.2 模糊評判矩陣的確定

設(shè)F0組的Jss、Kp、ER、Tlag數(shù)值等級為一般，按式(2)計算各指標等級差，其等級標準見表2。

表2 各評價指標的等級標準

(2)

選擇梯形模型分布隸屬函數(shù),從而確保各組模糊評判矩陣有合適的隸屬函數(shù)，對不同促透劑的各指標按式(3)計算評價矩陣R：

(3)

1.7.3 熵權(quán)法確定評價指標的權(quán)重系數(shù)

在具有i個評價指標、j個評價標準的系統(tǒng)中，根據(jù)定性和定量的原則得到矩陣R，根據(jù)熵權(quán)法按式(4)計算不同促透劑各評價指標的權(quán)重值：

(4)

式中：Hi為第i個指標的熵；Wi為第i個指標的權(quán)重(0≤Wi≤1,∑Wi=1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系

精密吸取12.5 μL、25 μL、125 μL、250 μL、500 μL、1 000 μL蘆丁標準溶液置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按1.6.2色譜條件進樣測定。以蘆丁濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程為y=17.888x-3.0442，R=0.9999。表明，蘆丁濃度在0.5～40 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度

取蘆丁標準溶液，按1.6.2色譜條件于同一天重復(fù)進樣6次，考察日內(nèi)精密度，計算蘆丁峰面積的RSD值為1.34%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

取蘆丁標準溶液，按1.6.2色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h進樣測定，計算蘆丁峰面積的RSD值為1.74%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 加標回收率

精密吸取6份已知含量的透皮接收液，分別精密加入蘆丁標準溶液，按1.6.2色譜條件進樣測定，計算加標回收率為98.21%，RSD值為2.09%。

2.2 不同促透劑對刺山柑凝膠劑透皮吸收的影響

將時間-藥物累積滲透量進行零級、一級、Higuchi方程、Ritger-Peppas動力學(xué)方程擬合，結(jié)果見表3。

表3 含氮酮刺山柑凝膠劑體外釋藥模型擬合結(jié)果

由表3可知，以各模型擬合方程的R2值接近1的程度來進行擬合方程最佳判斷，確定刺山柑凝膠劑體外釋藥規(guī)律均符合Higuchi方程。根據(jù)Higuchi方程分別計算得到Jss、Kp、ER、Tlag，結(jié)果見表4。含不同促透劑刺山柑凝膠劑的皮膚殘留量見圖2。

表4 不同促透劑對刺山柑凝膠劑經(jīng)皮吸收參數(shù)的影響

圖2 含不同促透劑刺山柑凝膠劑的皮膚殘留量

由表4、圖2可知，在不含促透劑和含不同促透劑的刺山柑凝膠劑系列處方組中，1%氮酮組(F1)的Jss、Kp、ER最優(yōu)；3%薄荷醇組(F5)的Tlag最優(yōu)；1%油酸組(F8)的Qs最優(yōu)。

2.3 熵權(quán)模糊綜合評價分析

按熵權(quán)法得到各評價因素的權(quán)重分配W=[w1,w2,w3,…,wn]，不同促透劑各評價指標的權(quán)重系數(shù)見表5。

表5 不同促透劑各評價指標的權(quán)重系數(shù)

根據(jù)各評判指標的權(quán)重系數(shù)通過模糊變換，可得到論域上的一個模糊子集，即綜合評判結(jié)果：B=W，R=[b1,b2,b3,…,bm]，不同促透劑對刺山柑凝膠劑促透作用的歸屬見表6。

表6 不同促透劑對刺山柑凝膠劑促透作用的歸屬

從表6可知，1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮的評語分別為良、優(yōu)、一般，其評語的最大隸屬度分別為0.619 6、0.716 4、1.025；1%薄荷醇、3%薄荷醇、5%薄荷醇的評語分別為中、優(yōu)、一般，其評語的最大隸屬度分別為0.667 3、0.669 6、0.745 6；5%丙二醇的評語為一般，其評語的最大隸屬度為1.344；1%油酸、3%油酸、5%油酸的評語分別為良、良、一般，其評語的最大隸屬度分別為0.925 4、1.305、0.584 4；2%氮酮+2%薄荷醇的評語為中，其評語的最大隸屬度為1.058，2%氮酮+2%丙二醇的評語為中，其評語的最大隸屬度為0.994 4。表明，3%氮酮對刺山柑凝膠劑具有最佳的透皮吸收促進作用。

2.4 討論

在體外透皮實驗中，接收液的選擇尤為重要。較常使用的接收液主要是磷酸緩沖液、生理鹽水等。對于水溶性差的藥物則常會在接收液中添加一些非生理性成分如乙醇、聚乙二醇、丙二醇[10]等，以增大藥物的溶解度。刺山柑凝膠劑中活性成分蘆丁在水中的溶解度較小,本研究以磷酸緩沖液作為接收液并分別加入不同體積分數(shù)乙醇，在增大蘆丁溶解度的同時可使角質(zhì)層膨脹疏松，增加皮膚的通透性,促進透皮，從而減少時滯，縮短實驗時間。在考察蘆丁在不同溶液中的溶解度時發(fā)現(xiàn)，20%乙醇-磷酸緩沖液可增大蘆丁的溶解度，且乙醇體積分數(shù)對皮膚正常生理功能的影響較小，故以此為接收液。

刺山柑作為傳統(tǒng)中藥，在民間以果實、根皮等搗碎敷在患處使用，以治療痛風、關(guān)節(jié)腫脹疼痛等病況。作者所在課題組以此為基點進行系列研究[7,11]，以促進制劑開發(fā)。但經(jīng)皮給藥的局限在于皮膚的屏障作用，角質(zhì)層屏障效應(yīng)最強，易阻滯藥物的經(jīng)皮吸收[12]。本研究為提高刺山柑凝膠劑的生物利用度，分別考察了氮酮、薄荷醇、丙二醇、油酸及其聯(lián)合使用對經(jīng)皮吸收的影響，結(jié)果顯示不同促透劑對其均有促進作用。但各促透劑的促透指標各有優(yōu)劣，并不能就單一指標評價各促透劑的綜合促透能力，因此采用熵權(quán)模糊綜合評判模型進行評價篩選，既能避免主觀意識對結(jié)果的干擾，也能將評價指標進行模糊變化再使其定量化，客觀有效得出清晰準確的結(jié)果。

3 結(jié)論

采用改良型Franz立式擴散池進行體外透皮實驗，通過HPLC法測定刺山柑凝膠劑中有效成分蘆丁含量，以穩(wěn)態(tài)流量、滲透系數(shù)、滯后時間、增滲倍數(shù)、皮膚殘留量為評價指標，基于熵權(quán)模糊綜合評判模型研究不同促透劑及其用量對刺山柑凝膠劑中蘆丁透皮吸收特征的影響，優(yōu)化刺山柑凝膠劑處方。結(jié)果表明，刺山柑凝膠劑體外釋藥規(guī)律符合Higuchi方程，透皮速率恒定；熵權(quán)模糊綜合評價顯示3%氮酮的促透能力最佳，其評語為優(yōu)的最大隸屬度為0.716 4。3%氮酮能有效促進刺山柑凝膠劑中蘆丁的體外透皮吸收，可作為刺山柑凝膠劑的促透劑。