馮豪雙，張憲方，熊俊，冀凱宏，徐莎,3

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 a.學(xué)員六隊(duì)，b.組織胚胎學(xué)教研室，上海 200433； 2.上海市胰腺疾病研究所，上海 200433；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室，上海 200433)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率居第三位，并呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前手術(shù)切除是治療RCC最有效的方法，但大部分患者在確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，且腫瘤對(duì)放化療及免疫治療不敏感，而靶向治療存在短期耐藥現(xiàn)象，通常RCC患者的預(yù)后較差[2-3]。RCC的發(fā)生發(fā)展過程受諸多因素影響，且其本身也是多基因相關(guān)性腫瘤，基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常改變也是導(dǎo)致RCC的重要原因之一[4]?；虮磉_(dá)調(diào)控受基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平三方面的影響，同時(shí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白產(chǎn)物的降解也決定基因表達(dá)量。非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)及其功能的揭示豐富了對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識(shí)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，因缺乏有意義的開放閱讀框而不具備編碼蛋白的功能，所以最初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄時(shí)的“噪音”，無生物學(xué)功能活性[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA具有組織和細(xì)胞特異性，在正常發(fā)育和疾病中扮演重要角色。lncRNA在腫瘤中常異常表達(dá)，發(fā)揮促癌或抑癌作用，參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[6]。深入了解lncRNA在RCC中的作用機(jī)制，有助于闡明RCC的發(fā)生發(fā)展過程。現(xiàn)就lncRNA在RCC進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制這一視角，分別從lncRNA與微RNA(microRNA，miRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、蛋白等相互作用參與基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的多種維度，總結(jié)lncRNA在RCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，探討潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 lncRNA的結(jié)構(gòu)與功能

lncRNA的結(jié)構(gòu)與mRNA類似，5′端和3′端分別存在7-甲基鳥嘌呤帽子和poly A尾，大多需要剪接才能成為成熟分子[7]。lncRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)保守性差，但二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度保守性，這些高保守的特定核苷酸序列或空間結(jié)構(gòu)往往與其復(fù)雜的生物學(xué)功能密不可分[8]，如部分lncRNA的雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)參與染色質(zhì)重構(gòu)，三葉草結(jié)構(gòu)參與大腦發(fā)育過程[9]。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，lncRNA在X染色體沉默、基因組印跡、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活與干擾等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10-12]。lncRNA的作用模式可以歸納為以下4種[13]：①作為信號(hào)分子，lncRNA在特定信號(hào)通路下轉(zhuǎn)錄后，直接結(jié)合鄰近部位的DNA，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。如lncRNA KCNQ1DN(KCNQ1 downstream neighbor)抑制c-Myc啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[14]。②作為引導(dǎo)分子，lncRNA與結(jié)合蛋白(通常為轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合后定位到特定的序列上，以順式或反式作用介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。如lncRNA腫瘤易感性候選基因15與轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合定位到Y(jié)染色體性別決定區(qū)框4 啟動(dòng)子區(qū)增強(qiáng)其表達(dá)[15]。③作為誘餌分子，lncRNA可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合蛋白或miRNA，阻斷相應(yīng)分子的作用及下游信號(hào)通路。如lncRNA 尿路上皮癌胚抗原1能與核不均一核糖核蛋白Ⅰ結(jié)合，從而阻斷核不均一核糖核蛋白 Ⅰ 對(duì)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子p27kip1的翻譯調(diào)控[16]。④作為支架分子，類似蛋白復(fù)合體的骨架，多個(gè)相關(guān)蛋白結(jié)合至同一條lncRNA分子上，實(shí)現(xiàn)不同信號(hào)通路之間的信息交匯與整合。如lncRNA 細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑4基因座的反義RNA是典型的支架分子，其結(jié)合并募集多梳蛋白復(fù)合體1和復(fù)合體2，導(dǎo)致染色質(zhì)狀態(tài)改變，從而抑制下游基因的表達(dá)[17]。以上4種作用模式相互關(guān)聯(lián)，協(xié)同發(fā)揮lncRNA的功能。

2 lncRNA與RCC

系統(tǒng)lncRNA表達(dá)譜分析顯示，RCC中存在大量lncRNA的異常表達(dá)[18-19]，引起蛋白表達(dá)和功能以及相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路改變，與RCC的發(fā)生發(fā)展、診斷、預(yù)后及耐藥性密切相關(guān)。如具有促癌作用的lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)[20-21]，具有抑癌作用的lncRNA分化拮抗非蛋白質(zhì)編碼RNA[22]，可作為潛在的無創(chuàng)血清學(xué)指標(biāo)的lncRNA uc009yby.1和ENST0000050687[23]，與患者遠(yuǎn)期生存率相關(guān)的lncRNA NONHSAT123350[2]，與治療耐藥性相關(guān)的生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5[24]等。這些lncRNA在RCC中的作用模式主要是以順式作用或反式作用的方式與各類RNA分子[14,25-26]、蛋白相互作用[21,27-28]，參與組蛋白修飾[29-30]，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、表觀遺傳水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。與其他較小的非編碼RNA相比，lncRNA具有較長(zhǎng)的序列以及復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，其在基因調(diào)控機(jī)制中所扮演的角色具有多樣性和復(fù)雜性。

2.1lncRNA與miRNA的相互作用 miRNA是一類由基因編碼的長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通常與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。lncRNA與miRNA之間可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)生特異性結(jié)合，形成復(fù)雜而微妙的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2011年，Salmena等[31]提出競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)假說，認(rèn)為RNA之間可通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合共同的miRNA反應(yīng)元件實(shí)現(xiàn)相互調(diào)節(jié)。隨著研究的深入，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)可作為ceRNA影響RCC疾病相關(guān)的生物學(xué)行為。lncRNA生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5因在生長(zhǎng)停滯細(xì)胞中高表達(dá)而得名，在多數(shù)腫瘤組織中低表達(dá)，并作為重要的抑癌基因在RCC中調(diào)控多種生物學(xué)過程。生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5通過吸附以人鋅鐵調(diào)控蛋白-1為靶點(diǎn)的miR-223，影響細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]；功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5作為ceRNA介導(dǎo)miR-21/Y染色體性別決定區(qū)框5途徑，進(jìn)而影響RCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥[24]。此外，?；撬嵘险{(diào)基因1、鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本1等也被證實(shí)能作為ceRNA影響RCC細(xì)胞的生物學(xué)行為以及耐藥性[26,33-34]，這為解決RCC臨床耐藥提供了參考依據(jù)，并為RCC的臨床治療提供了新靶點(diǎn)。

此外，miRNA又可反向調(diào)控lncRNA。lncRNA MALAT-1首先在非小細(xì)胞肺癌中被發(fā)現(xiàn)，并在多種腫瘤組織包括RCC中表達(dá)上調(diào)[35]。MALAT-1通過靶向miR-22-3p使其表達(dá)下調(diào)，激活下游信號(hào)通路促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移[25]；研究還發(fā)現(xiàn)miR-22-3p抑制劑能顯著上調(diào)MALAT-1的表達(dá)，表明lncRNA與miRNA之間存在雙向調(diào)控。多條lncRNA也可以靶向同一條miRNA，miR-137是lncRNA鋅指蛋白多型2反義鏈1和lncRNA核仁小分子RNA宿主基因1的共同靶標(biāo)，miR-137受到這兩條lncRNA的負(fù)調(diào)控，進(jìn)而協(xié)同影響RCC的發(fā)生發(fā)展過程[36-37]。

2.2lncRNA對(duì)mRNA的調(diào)控作用 lncRNA可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與基因啟動(dòng)子直接結(jié)合，進(jìn)而影響下游mRNA的轉(zhuǎn)錄過程。Yang等[14]報(bào)道，lncRNA KCNQ1DN經(jīng)與c-Myc啟動(dòng)子區(qū)的序列結(jié)合，導(dǎo)致c-Myc轉(zhuǎn)錄受阻，從而抑制RCC細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)。此外，lncRNA也能招募轉(zhuǎn)錄因子至鄰近靶基因的啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。臨床上使用索拉菲尼治療RCC常出現(xiàn)耐藥，其原因在于高表達(dá)的腎癌索拉非尼耐藥相關(guān)的lncRNA募集核因子κB至白細(xì)胞介素-6的啟動(dòng)子區(qū)并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而激活下游信號(hào)通路，引起RCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥[38]。Song等[39]的研究表明，高表達(dá)的被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化的lncRNA與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1蛋白結(jié)合后，增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，提升DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與p53啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力，下調(diào)p53轉(zhuǎn)錄水平，增加RCC細(xì)胞的增殖和遷移速率并抑制細(xì)胞凋亡。lncRNA也可通過招募RNA結(jié)合蛋白，在轉(zhuǎn)錄后水平共同實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控。FoxO基因誘導(dǎo)的lncRNA 1是一種與能量應(yīng)激相關(guān)的lncRNA，與富含AU堿基的RNA結(jié)合蛋白1相互作用后阻斷下游c-Myc mRNA的翻譯，導(dǎo)致葡萄糖攝取以及乳酸產(chǎn)量減少，促進(jìn)RCC細(xì)胞凋亡[40]，表明lncRNA作為負(fù)調(diào)節(jié)子在腫瘤發(fā)展中參與能量代謝相關(guān)的新的調(diào)控機(jī)制。另外，還有由蛋白編碼基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來的lncRNA能提高反義鏈mRNA的穩(wěn)定性。lncRNA表皮生長(zhǎng)因子受體反義鏈1(epidermal growth factor receptor antisense RNA 1，EGFR-AS1)是EGFR的反義轉(zhuǎn)錄物，與EGFR具有部分序列互補(bǔ)性，EGFR-AS1通過與人抗原R結(jié)合以維持EGFR mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)RCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[41]，提示EGFR-AS1可作為一個(gè)較為理想的藥物靶點(diǎn)。

2.3lncRNA與蛋白之間的相互作用 lncRNA具有相對(duì)較長(zhǎng)的核苷酸鏈，其分子內(nèi)部可形成特定而復(fù)雜的二級(jí)空間結(jié)構(gòu)，能提供與蛋白結(jié)合的多個(gè)位點(diǎn)，影響蛋白的穩(wěn)定性和活性。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式調(diào)控作用的lncRNA，由HOX基因座轉(zhuǎn)錄而來[42]，通過多種調(diào)控通路發(fā)揮生物學(xué)功能。除作為ceRNA吸附miRNA以及參與表觀遺傳調(diào)控外[43-44]，研究還發(fā)現(xiàn)HOTAIR與Salvador同源物1直接結(jié)合，導(dǎo)致該蛋白功能喪失，進(jìn)而激活下游Hippo信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[27]。lncRNA SARCC(suppressing androgen receptor in renal cell carcinoma)與雄激素受體結(jié)合后導(dǎo)致穩(wěn)定性下降，雄激素受體活性降低，進(jìn)而阻遏下游信號(hào)途徑，實(shí)現(xiàn)對(duì)RCC細(xì)胞侵襲、遷移和增殖的調(diào)控[29]。lncRNA MALAT-1通過lncRNA-蛋白質(zhì)相互作用和穩(wěn)定蛋白質(zhì)引起Livin蛋白質(zhì)上調(diào)，共同介導(dǎo)RCC細(xì)胞增殖，并促進(jìn)轉(zhuǎn)移[21]。由此可見，lncRNA與蛋白之間的直接相互作用是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的一種普遍機(jī)制。

2.4lncRNA介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控 細(xì)胞遺傳信息的表達(dá)既有賴于基因組DNA序列，也受制于表觀遺傳學(xué)信息。表觀遺傳調(diào)控是通過修飾基因而非改變基因序列實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的改變，主要在DNA修飾、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)等方面介導(dǎo)基因表達(dá)，其調(diào)控異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中較常見[45-46]。lncRNA可通過與多種表觀遺傳復(fù)合物相互作用，介導(dǎo)下游DNA的甲基化、組蛋白修飾等，從而抑制或激活基因的表達(dá)。Hirata等[29]研究證實(shí)，敲低MALAT-1后可引起與其結(jié)合的果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)表達(dá)減少，降低了下游上皮鈣黏素啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3的27位賴氨酸甲基化水平，上調(diào)上皮鈣黏素的表達(dá)，進(jìn)而抑制RCC細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。這種經(jīng)甲基化水平影響下游基因表達(dá)的機(jī)制也同樣存在于與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)的lncRNA TP73反義RNA 1和KiSS-1轉(zhuǎn)移抑制基因啟動(dòng)子區(qū)[47]。lncRNA HOXA遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄本可作為分子支架，同時(shí)招募EZH2和賴氨酸特異性去甲基化酶1與之結(jié)合，協(xié)同調(diào)控腫瘤抑制激酶2基因的沉默，從而影響RCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡[30]。lncRNA HOTAIR既能與miRNA和蛋白相互作用，又能通過重構(gòu)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)促進(jìn)RCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。敲低HOTAIR可引起組蛋白脫甲基酶含Jumonji結(jié)構(gòu)域蛋白3的減少，導(dǎo)致其下游靶基因Snail轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)，而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2靶基因原鈣黏蛋白β5表達(dá)增加[40]。以上研究表明，HOTAIR作為RCC轉(zhuǎn)移的重要啟動(dòng)子，通過影響不同基因位點(diǎn)的組蛋白甲基化和去甲基化，雙重調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)。另外，lncRNA參與下游基因的乙?；揎椧驳玫阶C實(shí)。

由溶質(zhì)載體47家族第2成員(solute carrier family 47,member 2，SLC47A2)基因座轉(zhuǎn)錄而來的lncRNA SLC47A2基因非mRNA轉(zhuǎn)錄本1能與脯氨酸-谷氨酰胺富含性剪接因子/E2F轉(zhuǎn)錄因子1/組蛋白去乙?；笍?fù)合體結(jié)合形成功能性lncRNA-蛋白復(fù)合物。在鄰近腫瘤的癌旁組織中，SLC47A2基因座高表達(dá)SLC47A2基因非mRNA轉(zhuǎn)錄本1，誘導(dǎo)脯氨酸-谷氨酰胺富含性剪接因子/E2F轉(zhuǎn)錄因子1/組蛋白去乙?；笍?fù)合體與SLC47A2啟動(dòng)子區(qū)的脫靶，引起啟動(dòng)子區(qū)高水平的組蛋白H3的27位賴氨酸乙酰化修飾，同時(shí)也增強(qiáng)了RNA聚合酶Ⅱ與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合；相反，RCC中低表達(dá)的SLC47A2基因非mRNA轉(zhuǎn)錄本1則增強(qiáng)了脯氨酸-谷氨酰胺富含性剪接因子/E2F轉(zhuǎn)錄因子1/組蛋白去乙?；笍?fù)合體在SLC47A2啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，導(dǎo)致SLC47A2編碼區(qū)表達(dá)沉默[48]。表觀遺傳學(xué)的某些改變具有可逆性，這為靶向表觀遺傳治療疾病提供了理論依據(jù)。但目前缺乏針對(duì)表觀遺傳治療的特異性基因位點(diǎn)，且lncRNA作用的時(shí)空特異性、自身的分子狀態(tài)等也需要深入研究。

3 結(jié) 語

隨著全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和lncRNA芯片技術(shù)的不斷升級(jí)以及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，更多與RCC相關(guān)的lncRNA陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和研究。除上文提及的lncRNA與miRNA、mRNA、蛋白相互作用發(fā)揮功能以及調(diào)控表觀遺傳外，還可能有許多未知的分子類型與lncRNA存在互動(dòng)，尤其是lncRNA之間的相互影響。lncRNA是否具有翻譯成蛋白質(zhì)的能力是近年備受爭(zhēng)議的問題。Lu等[49]提出了由“非編碼”基因編碼的隱藏的人類蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)lncRNA編碼的新蛋白質(zhì)偏離了具有各種物理和化學(xué)特性的已知規(guī)范蛋白質(zhì)，在進(jìn)化過程中主要出現(xiàn)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，其中新蛋白質(zhì)UBAP1-AST6位于核仁中并優(yōu)先由肺癌細(xì)胞系表達(dá)，具有與細(xì)胞增殖相關(guān)的功能，這一發(fā)現(xiàn)更加拓展了lncRNA的生物學(xué)功能。lncRNA因數(shù)量多、物種間保守性較差、組織特異性及特定的細(xì)胞定位等導(dǎo)致對(duì)其作用機(jī)制的研究較為困難。從表型入手探究某一分子的作用機(jī)制是常用的研究手段，但lncRNA的生物學(xué)功能也離不開其一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，因此對(duì)lncRNA結(jié)構(gòu)的解析是深入研究其功能的另一條途徑。

針對(duì)特異性lncRNA靶點(diǎn)的治療方案以及靶向特異性lncRNA改善化療將是未來研究的一個(gè)方向。除了進(jìn)一步對(duì)lncRNA在細(xì)胞和動(dòng)物模型水平的機(jī)制進(jìn)行更深入的研究外，還需要針對(duì)藥物設(shè)計(jì)、藥物療效及藥物生物安全性方面進(jìn)行摸索與評(píng)價(jià)，以研發(fā)出靶向特異性lncRNA的藥物，從而為臨床治療RCC提供更多安全有效的治療方法，真正實(shí)現(xiàn)從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。