王思雨，張大昕

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤一科，哈爾濱 150001)

在腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中，新生血管為腫瘤生長輸送氧氣、提供養(yǎng)分。1971年，F(xiàn)olkman[1]首次提出血管生成的概念，并指出阻斷腫瘤新生血管生成是遏制腫瘤發(fā)展和侵襲的有效策略。此后，抗血管生成藥物被廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤中，血管靶向策略為抗腫瘤治療帶來新希望。內(nèi)皮抑素是O′Reilly等[2]于1997年首次從鼠血管內(nèi)皮瘤血清中發(fā)現(xiàn)并提取的一種內(nèi)源性蛋白，具有顯著的抗血管生成作用和廣泛的抗腫瘤譜。而可溶性內(nèi)皮抑素更具抗腫瘤活性，因此由我國自主研發(fā)的新一代抗血管生成藥物重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(商品名:恩度)應(yīng)運(yùn)而生，2005年美國食品藥品管理局正式批準(zhǔn)恩度作為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的一線用藥[3]。目前，最新指南明確指出，在晚期NSCLC、轉(zhuǎn)移性鼻咽癌以及惡性黑色素瘤中，恩度可作為推薦使用的藥物[4-5]。但目前單用抗血管治療尚無長期生存率的報(bào)道，因?yàn)榭寡苌芍荒茏钄嗄[瘤發(fā)展的某條或某些通路，并不能殺滅腫瘤細(xì)胞?；诖?，人們開始將血管靶向治療與傳統(tǒng)放化療聯(lián)合起來進(jìn)行研究。1995年，Teicher等[6]最先發(fā)現(xiàn)了抗血管生成治療對放療能起到加強(qiáng)作用。恩度能夠起到放療增敏作用，且不會增加對正常組織的毒性。現(xiàn)就恩度放療增敏作用機(jī)制的研究進(jìn)展予以綜述。

1 恩度的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及抗腫瘤作用機(jī)制

1.1結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 內(nèi)皮抑素是XVIII型膠原C端的一個(gè)20 000的片段，是最有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子之一，其一級結(jié)構(gòu)中包含184個(gè)氨基酸，二級結(jié)構(gòu)以β-折疊和環(huán)為主[2]。以往人們認(rèn)為內(nèi)皮抑素抗血管作用主要來自其中的鋅結(jié)合位點(diǎn)，但近年來有研究通過對內(nèi)皮抑素進(jìn)行變體后發(fā)現(xiàn)N端的二硫鍵環(huán)可能才是其抗腫瘤活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[7]。恩度是我國科學(xué)家研發(fā)的一種重組人血管內(nèi)皮抑制素，在天然內(nèi)皮抑素的母體基礎(chǔ)上添加了9個(gè)氨基酸序列，使得內(nèi)皮抑素的半衰期延長，穩(wěn)定性提高，生物活性增強(qiáng)，由于其蛋白表達(dá)體系來源于大腸埃希菌，故解決了內(nèi)皮抑素容易形成包含體的問題[8]。

1.2抗腫瘤作用機(jī)制

1.2.1作用于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR) 機(jī)體對腫瘤新生血管的調(diào)控符合雙向調(diào)節(jié)的普遍規(guī)律，是正性調(diào)控因子和(或)負(fù)性調(diào)控因子相互作用的復(fù)雜過程。VEGF家族是促進(jìn)新生血管形成最重要的正性調(diào)控因子之一，在腫瘤血管生成的調(diào)控中起主導(dǎo)作用，恩度能夠下調(diào)VEGF的表達(dá)水平并作用于VEGFR，使VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合受阻，下調(diào)VEGF-VEGFR所介導(dǎo)的下游信號通路，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖與遷移[9]。

1.2.2作用于基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP) MMP是一個(gè)大家族，主要功能為降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中的蛋白成分。在TME中，腫瘤細(xì)胞與基膜表面的受體結(jié)合后分泌MMP等降解酶，降解ECM，腫瘤侵襲的組織學(xué)屏障被破壞，使腫瘤細(xì)胞得以沿基質(zhì)空隙和基底膜缺損向周圍侵襲生長，而內(nèi)皮抑素可以與MMP的前體結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻止MMP活化，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲[10]。Xu等[11]在H22肝癌小鼠模型中證實(shí)，應(yīng)用恩度可顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9水平，并使腫瘤微血管密度顯著降低。

1.2.3作用于核仁素 腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的表面有復(fù)雜、相互作用的網(wǎng)絡(luò)，其中核仁素起重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與核仁素的磷酸化緊密相關(guān)[12]。內(nèi)皮抑素可結(jié)合處于增殖狀態(tài)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的核仁素，并被其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，抑制核仁素的磷酸化，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖[13]。但由于核仁素只在血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性表達(dá)，所以恩度對其他細(xì)胞(如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)無作用[14]，因此安全性較高。

1.2.4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控細(xì)胞的自主有序性死亡，是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而進(jìn)行的程序化過程。Bcl-2家族是一個(gè)重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族，其低表達(dá)可促使細(xì)胞凋亡，而內(nèi)皮抑素可以通過抑制Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮的凋亡，導(dǎo)致腫瘤新生血管的衰退[15]。也有研究認(rèn)為，內(nèi)皮抑素可與原肌球蛋白相互作用，破壞微絲的完整性，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素不是血管特異性的，它可以直接作用于腫瘤細(xì)胞本身，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[17]。

2 恩度的放療增敏作用機(jī)制

2.1提供血管正?；瘯r(shí)間窗 氧能促進(jìn)活性氧類和自由基的產(chǎn)生，是已知的有效放射增敏劑。然而，缺氧在腫瘤中十分常見，在大多數(shù)實(shí)體瘤中，新形成的腫瘤微血管形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂、基膜不完整，導(dǎo)致血流紊亂、淤滯，甚至出現(xiàn)反向流動、血管塌陷。這種異常的血管結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致血流量減少、血流灌注異質(zhì)化，加重腫瘤內(nèi)部缺氧。在缺氧的TME下，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和VEGF的表達(dá)均上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤新生血管生成，降低了放療的敏感性；同時(shí)，放療本身還可通過上調(diào)促血管生成因子(如VEGF、血小板衍生生長因子)和促存活因子(如Bcl-2、Bcl-xL)，誘導(dǎo)新生血管形成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，引起放療抵抗[18-19]。這使得放療與血管生成形成了一個(gè)不可避免的惡性循環(huán)。以往人們認(rèn)為，抗腫瘤血管生成會加重腫瘤細(xì)胞缺氧，降低放療的效果，但Jain[20]指出，血管生成抑制劑可以修剪腫瘤新生血管，使其短暫地“正?；?，并使其更有效地進(jìn)行氧氣和藥物輸送，從而提高常規(guī)療法的療效。血管正常化給放療提供了一個(gè)窗口期，在這個(gè)窗口期內(nèi)腫瘤微血管的功能與正常血管接近，缺氧細(xì)胞比例降低，腫瘤細(xì)胞對放射線敏感性提高[21]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，惡性腦膠質(zhì)瘤患者接受Cediranib(AZD2171)治療后血管的正?；癄顟B(tài)可能是可逆的[22]，提示時(shí)間窗的選擇在聯(lián)合治療中至關(guān)重要。郝美麗等[23]通過對小鼠胃癌移植瘤模型的研究，發(fā)現(xiàn)恩度治療后腫瘤血管正?；臅r(shí)間窗為第5～9天，且該時(shí)間窗內(nèi)微血管密度降低，Ⅳ型膠原表達(dá)增多，HIF-1α表達(dá)減少，可見恩度在該時(shí)間窗內(nèi)可使腫瘤微血管減少、基膜完整、周細(xì)胞覆蓋率增加、TME的缺氧狀態(tài)得以改善，從而打破放療與血管生成的不良循環(huán)，起到放療增敏效應(yīng)。蔣曉東[24]在肺癌患者使用恩度治療后第1、5、10天進(jìn)行缺氧顯像和CT灌注成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血流量呈現(xiàn)先升高后降低的“倒U型”趨勢，并在第5天達(dá)到峰值。楊振東[25]在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用超聲造影技術(shù)評價(jià)了恩度誘導(dǎo)鼻咽癌患者腫瘤血管正?；?yīng)，結(jié)果顯示，出現(xiàn)血管正?；ㄐ蔚臅r(shí)間窗約為應(yīng)用恩度后5 d內(nèi)，與動物實(shí)驗(yàn)的正常化時(shí)間窗基本吻合。

2.2下調(diào)促血管生成因子水平 VEGF、HIF-1α是已知的可由放療誘導(dǎo)、引起放療抵抗的促血管生成因子。HIF-1α是一種在缺氧條件下穩(wěn)定表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，激活后可轉(zhuǎn)錄下游的多種基因，使組織、細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。在腫瘤組織中，HIF-1α可維持腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮在缺氧環(huán)境中內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使其免受放療損傷，加速腫瘤新生血管形成，降低腫瘤組織對射線的敏感性[12]，而抑制VEGF、HIF-1α可提高放療的療效。劉亮等[26]的體外研究表明，恩度能增強(qiáng)VEGFR-2信使RNA高表達(dá)的NSCLC細(xì)胞系Calu-1細(xì)胞的放射敏感性，推測其作用機(jī)制可能為恩度抑制了VEGFR-2的表達(dá)，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B與促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶兩條非缺氧途徑下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性。楊曉軍等[27]在一項(xiàng)針對Ⅲa期肺癌患者的研究中，通過對腫瘤組織進(jìn)行基因檢測，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)VEGFR-1和VEGFR-2的患者在應(yīng)用恩度后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率降低，提示VEGFR的表達(dá)水平可能是恩度輔助治療潛在的療效預(yù)測因子。另有研究顯示，恩度能夠降低小鼠肝癌組織中VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9以及白細(xì)胞介素-17的水平[11]，而VEGF、HIF-1α、MMP-2、MMP-9以及白細(xì)胞介素-17等可以不同的方式參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，刺激新生血管形成。這個(gè)過程是否與放療誘導(dǎo)有關(guān)目前尚無定論，可能是恩度聯(lián)合放療增敏的機(jī)制之一，有待于進(jìn)一步研究。

2.3使細(xì)胞周期阻滯于放療敏感期 細(xì)胞周期進(jìn)程為：DNA合成前期(G1期)→DNA合成期(S期)→DNA合成后期(G2期)→分裂期(M期)。處于不同細(xì)胞周期時(shí)相的腫瘤細(xì)胞對放射線的敏感性存在差異，一般認(rèn)為，G2/M期的細(xì)胞對放療最為敏感，G1期次之，S期敏感性最低[28]。腫瘤細(xì)胞在缺氧的TME中G2/M期時(shí)間顯著縮短，故腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出對放療的抗拒[29]。因此，如果可以調(diào)整腫瘤組織中細(xì)胞所處的細(xì)胞周期狀態(tài)，使其同步化于對射線敏感的時(shí)相，就能夠增加細(xì)胞的放療敏感性。Zhang等[30]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)評價(jià)了應(yīng)用恩度對人肺癌A549細(xì)胞的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥后處于G2/M期、S期的細(xì)胞增加，且以G2/M期增加為主，由此推測，恩度可能是通過使細(xì)胞阻滯于G2/M期，增強(qiáng)了A549肺癌細(xì)胞的放射敏感性。Liu等[31]進(jìn)行的食管癌細(xì)胞Eca109體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，恩度與放療聯(lián)合組G2/M期、S期細(xì)胞的百分率較對照組和放療組顯著降低，而G0/G1期細(xì)胞百分率顯著升高，放療組與聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率均高于對照組，且聯(lián)合組高于放療組，故認(rèn)為恩度可能通過細(xì)胞周期阻滯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式增加放療的敏感性。此外，處于對放療不敏感時(shí)相的腫瘤細(xì)胞的存活是放療后腫瘤復(fù)發(fā)的根源，恩度通過非特異性抑制細(xì)胞增殖，作用于處于S期的腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到減輕放療抵抗、抑制腫瘤生長的目的[32]。

2.4誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡 Folkman[14]在關(guān)于惡性腫瘤的“二室模型”中提出，內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞兩種群體可相互永久性誘導(dǎo)各自與腫瘤惡性程度相關(guān)的表型表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增，惡性程度也隨之增加。放療可引起DNA單鏈或雙鏈斷裂，通過使細(xì)胞停滯在特定細(xì)胞周期內(nèi)(或細(xì)胞崩解)起到殺傷內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞作用；而放療引起細(xì)胞DNA單雙鏈斷裂后，細(xì)胞會激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)使細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期停滯，為DNA的修復(fù)提供時(shí)間[33]。恩度可能通過抑制細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來協(xié)同放療殺傷，具體機(jī)制很可能是多通路、多靶點(diǎn)的，有待進(jìn)一步研究明確。蔣曉東[24]通過對A549肺腺癌裸鼠移植瘤的研究發(fā)現(xiàn)，恩度與放療聯(lián)合組的腫瘤細(xì)胞凋亡增多，腫瘤退縮早，較單獨(dú)治療組具有更好的腫瘤控制。Meng等[34]的研究表明，恩度可在多種NSCLC細(xì)胞中抑制高遷移率族蛋白B1的表達(dá)與釋放，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Yan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素還可抑制DNA-蛋白激酶C，影響其磷酸化，導(dǎo)致DNA損傷累積，從而誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡；體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，恩度與人凋亡相關(guān)新基因DESI2(desumoylating isopeptidase 2)聯(lián)用治療較單一治療可更顯著地抑制腫瘤生長，并有效延長荷瘤小鼠的存活時(shí)間。

2.5改善TME TME是一個(gè)時(shí)刻發(fā)生動態(tài)變化的復(fù)雜環(huán)境，其免疫狀態(tài)與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，恩度可以顯著降低腫瘤組織中骨髓來源抑制性細(xì)胞、M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，增加成熟樹突狀細(xì)胞和M1型、M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量，并可使更多的CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中，使腫瘤內(nèi)部抑制免疫應(yīng)答的微環(huán)境逆轉(zhuǎn)為促進(jìn)免疫應(yīng)答的微環(huán)境[36]。程序性死亡受體1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的免疫抑制分子，能夠抑制T細(xì)胞炎癥活動，促進(jìn)免疫逃逸。Wu等[37]研究表明，抗程序性死亡受體1聯(lián)合恩度能夠顯著抑制Lewis肺癌小鼠模型中的腫瘤生長，這種協(xié)同效應(yīng)可導(dǎo)致VEGF表達(dá)顯著下調(diào)、白細(xì)胞介素-17和轉(zhuǎn)化生長因子-β1水平降低、骨髓來源抑制性細(xì)胞積聚減少以及CD8+T淋巴細(xì)胞抑制狀態(tài)逆轉(zhuǎn)，而腫瘤細(xì)胞凋亡和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白介導(dǎo)的自噬均上調(diào)。腫瘤血管正常化與免疫重編程之間相互調(diào)節(jié)形成一個(gè)加強(qiáng)環(huán)路，誘導(dǎo)強(qiáng)效而持久的抗腫瘤免疫[38]。放療除了直接殺傷細(xì)胞外，還具有促進(jìn)局部和全身控制實(shí)體腫瘤的潛力，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。放療可將細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞募集到TME中，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，改變TME的免疫抑制狀態(tài)[39]，這與恩度對TME的影響類似，因此推測恩度對TME的逆轉(zhuǎn)可能也是其放療增敏作用的機(jī)制之一。抗血管生成治療與放療、免疫治療聯(lián)合是目前最有前景的研究方向之一，期待進(jìn)一步的機(jī)制揭示為治療惡性腫瘤提供新策略。

3 小 結(jié)

恩度對放療的增敏作用很可能是一個(gè)多通路、多步驟、多靶點(diǎn)的復(fù)雜過程。盡管近年來抗血管生成與放療聯(lián)合應(yīng)用的研究成果日漸增多，但大多仍處于臨床前期和臨床研究階段，且缺乏高級別的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。2018年的一項(xiàng)臨床研究顯示，持續(xù)輸注恩度聯(lián)合放化療雖然能獲得更好的總生存期，但并不能延長中位無進(jìn)展生存期[40]。未來，應(yīng)進(jìn)一步明確聯(lián)合治療的最佳時(shí)序與時(shí)機(jī)、選擇給藥的最佳途徑[41]、尋找可用于臨床的血管正?；飳W(xué)標(biāo)志物、建立更為可靠的療效預(yù)測手段和不良反應(yīng)評價(jià)體系以及明確可能受益的病種、優(yōu)勢人群等。