袁雨培綜述 唐其柱審校

據(jù)《中國心血管病報告2018》報道，我國心血管疾病現(xiàn)患人數(shù)2.9億，其中高血壓病2.45億例，心力衰竭450萬例[1]。心力衰竭是高血壓、冠心病、心肌病等多種心血管疾病的最終結(jié)局，盡管目前臨床藥物和器械輔助治療可延緩心力衰竭進程，心力衰竭患者的總體預(yù)后仍很差。心肌重構(gòu)貫穿心臟損傷的始終，是心血管疾病進展為心力衰竭必然經(jīng)歷的病理生理過程。心肌重構(gòu)是指心臟在損傷或血液動力學(xué)異常時，從基因到結(jié)構(gòu)的重建，最終導(dǎo)致心臟大小、形狀和功能發(fā)生改變。心肌重構(gòu)過程中，間質(zhì)發(fā)生纖維化，降低心臟順應(yīng)性，影響心臟的舒張功能；心肌細胞凋亡，數(shù)目減少，影響心臟的收縮功能。膠原纖維包裹心肌細胞導(dǎo)致電傳導(dǎo)障礙引發(fā)惡性心律失常；心肌細胞肥大導(dǎo)致血管密度相對降低，引發(fā)心肌缺氧。因此，需要深入研究心肌重構(gòu)的分子調(diào)控機制，以發(fā)現(xiàn)心肌重構(gòu)和心力衰竭治療的新靶點。

對于心肌重構(gòu)雖已進行了大量的研究，但其具體發(fā)生機制仍不十分明確，心肌細胞及其他非心肌細胞(成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等)的凋亡或增殖，心肌的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，纖維化及心肌內(nèi)血管生成等均被證明參與了心肌重構(gòu)發(fā)生發(fā)展[2-4]。而近期研究發(fā)現(xiàn)，Notch家族蛋白可參與調(diào)節(jié)上述多種過程，可能對心肌重構(gòu)發(fā)揮作用[5-6]。因此筆者結(jié)合最新研究，對Notch家族蛋白與心肌重構(gòu)的研究進展進行綜述，以期為進一步探究提供更多理論依據(jù)。

1 Notch受體家族概述

Notch受體家族是一種高度保守的膜蛋白受體家族，在哺乳動物中包含4個同源受體，即Notch1～4。Notch最早由Morgan在突變的果蠅中發(fā)現(xiàn)，該基因的功能缺失會導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺刻，后研究發(fā)現(xiàn)Notch也廣泛表達于脊椎動物、哺乳動物等多個物種中。Notch受體分子量為300 kD左右，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)包含數(shù)個表皮生長因子樣重復(fù)序列及保守的富含半胱氨酸位點，主要功能是和配體結(jié)合，激活Notch信號通路產(chǎn)生效應(yīng)；胞內(nèi)區(qū)包含1個RAM序列、6個CDC10/錨蛋白樣重復(fù)序列、2個核定位信號、1個轉(zhuǎn)錄激活區(qū)及1個PEST序列，主要功能是將Notch信號轉(zhuǎn)到細胞核內(nèi)。鄰近細胞的Notch胞外區(qū)與配體結(jié)合，在腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)換酶、γ-促分泌酶作用下發(fā)生2次蛋白裂解，形成可溶性Notch胞內(nèi)區(qū)活化形式(intracellular domain of Notch，NICD)進入細胞核，與初級轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，啟動下游靶基因的表達。高等動物Notch下游靶基因為Hes和Hey。除了CSL經(jīng)典通路外，Notch還被證明可以通過非CSL依賴的方式激活，如絲氨酸/絲氨酸特異性蛋白激酶的激活[7]。

目前對Notch信號通路的研究涉及胚胎的發(fā)育、免疫系統(tǒng)功能調(diào)控、腫瘤的發(fā)生、神經(jīng)退行性變及炎性反應(yīng)等病理生理過程。心血管方面，Notch的表達可在胚胎期心臟檢測到。其中Notch1主要表達于心臟的流出道、房室管、室壁小梁及心外膜，Notch2主要表達于房室管、肺動脈及主動脈，Notch3主要表達于肺動脈和主動脈，Notch4主要表達于主動脈內(nèi)皮。Notch1～3均在胚胎第11天開始有表達，12周期間達到峰值，Notch4起始表達量低，2周時達到高峰。Notch家族受體的表達參與調(diào)控心臟各部位的形成，在心臟發(fā)育中發(fā)揮重要的作用；其信號的缺失會導(dǎo)致各種先天性心臟病的發(fā)生[5]。Notch受體家族在心臟發(fā)育中的作用已得到廣泛探究，但在成人心臟中的作用研究尚未完全明確。

2 Notch受體家族與心肌重構(gòu)

現(xiàn)有研究顯示，在導(dǎo)致心肌重構(gòu)的不同疾病模型中，Notch受體家族各成員均參與了各種心肌重構(gòu)的發(fā)生過程，發(fā)揮不同的作用。

2.1 Notch1受體與心肌重構(gòu) 心肌重構(gòu)是在炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激或機械應(yīng)力等刺激下，心肌細胞及其他非心肌細胞發(fā)生凋亡。而抑制各種刺激因素，減緩細胞凋亡的發(fā)生可有效地抑制心肌重構(gòu)的進展。Rocca等[8]研究顯示，缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)會導(dǎo)致大鼠心肌損傷，心功能惡化；但激活Notch1后梗死面積減小，大鼠心功能明顯好轉(zhuǎn)。體外實驗顯示，Notch1過表達可降低心肌細胞凋亡率，即Notch1的心肌重構(gòu)保護作用可能是通過抑制細胞凋亡發(fā)揮的。同樣地，Du等[9]研究顯示，小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)模型組相對于對照組，Notch1及其活性成分N1ICD的轉(zhuǎn)錄及表達水平增加。而使用Notch1的激活劑后，心臟中丙二醛及一氧化氮合酶的含量明顯降低，凋亡陽性細胞數(shù)目及Caspase3的表達水平降低，即心肌中氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡水平降低；心肌損傷標(biāo)志物水平下降，心功能好轉(zhuǎn)。由此證明激活Notch1可通過抑制心臟內(nèi)氧化應(yīng)激水平并進一步減少細胞凋亡發(fā)揮保護作用。而抑制Notch1后，上述保護作用消失，氧化應(yīng)激反應(yīng)及凋亡程度上升。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)激活Notch1可通過抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生保護心肌，具體表現(xiàn)為Notch1可減少因MI導(dǎo)致的炎性因子如白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、單核細胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的轉(zhuǎn)錄及表達增加，減少心肌內(nèi)巨噬細胞浸潤，進一步抑制細胞凋亡，恢復(fù)心功能。

Notch1還被證明可通過抑制心肌重構(gòu)的關(guān)鍵過程——心肌纖維化來調(diào)控心肌重構(gòu)的發(fā)展。在轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激的成纖維細胞中，過表達Notch1后可觀察到成纖維細胞的增殖被明顯抑制，成纖維標(biāo)志物Ⅰ型膠原表達減少，且進一步機制探究顯示Notch1的這一作用是通過抑制纖維化相關(guān)通路TGF-β1/Smad發(fā)揮的[11]。在大鼠MI模型中，Notch1也被證實可與TGF-β1/Smad3通路相互拮抗，Notch1抑制TGF-β1及Smad3的激活，抑制纖維化標(biāo)志物的產(chǎn)生，減少成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，MI大鼠心肌纖維化減少，減輕心肌重構(gòu)的發(fā)生[12]。另外，在阿霉素(doxorubicin，DOX)導(dǎo)致的斑馬魚心臟損傷模型中，Notch1也被發(fā)現(xiàn)可以減少DOX導(dǎo)致的心肌纖維化，主要是通過抑制纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、TGF-β1以及結(jié)締組織生長因子的表達，并可進一步減少細胞凋亡[13]。

最新研究顯示，Notch1還與心臟中血管的生成密切相關(guān)。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)Notch1可增強MI模型大鼠的心功能，具體表現(xiàn)為側(cè)支循環(huán)血流量及心肌灌注增加，缺血心肌的體積減?。贿M一步對血管密度進行檢測發(fā)現(xiàn)，Notch1激活增加了微循環(huán)的血管數(shù)量及大小。Zhao等[15]研究表明，Notch1可促進血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子表達，進一步促進新生血管成熟，增加缺血心肌的局部血流，說明Notch1可通過調(diào)控心臟內(nèi)血管的生成及成熟對抗心肌重構(gòu)的發(fā)生。Notch1還被證明與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)在I/R小鼠心肌重構(gòu)模型中，過表達Notch1可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵酶蛋白，如激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、α亞基的真核起始因子2及C/EBP同源蛋白的激活或表達，進一步減少細胞凋亡，緩解心肌重構(gòu)的發(fā)生，改善心功能。

另外，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal cells，MSC)的激活、增殖和遷移對于心臟損傷的修復(fù)有重要作用；且有研究顯示，心力衰竭患者的脂肪間充質(zhì)干細胞中Notch1表達明顯下調(diào)[17]。而最新研究顯示，MI模型小鼠中，Notch1可通過介導(dǎo)血清外顯體的表達，促進內(nèi)源性間充質(zhì)干細胞的激活，促進VEGF的表達及血管生成，有助于心臟損傷修復(fù)[18]。

2.2 Notch2受體與心肌重構(gòu) 現(xiàn)已有大量研究證明，Notch2在心臟發(fā)育中的作用至關(guān)重要，它參與心肌細胞的增殖、分化和凋亡等過程，敲除Notch2可能會導(dǎo)致心肌肥厚、致密化減少和室間隔缺損等問題[19-21]。但其在成熟心臟中的作用研究較少。Richard等[22]研究顯示，小鼠I/R損傷后，心臟中Notch2轉(zhuǎn)錄水平相對于假手術(shù)組明顯下降；外源性給予二十二碳六烯酸激活Notch2后，心肌梗死面積減小，氧化應(yīng)激水平降低，心臟耗氧量、ATP消耗及肌酸激酶的釋放均減少，即Notch2的表達可通過調(diào)控氧化應(yīng)激發(fā)揮心臟保護作用。另外，在豬慢性缺血心臟損傷模型中，高脂飼料喂養(yǎng)組相對于正常飼料組Notch2的表達下降，細胞凋亡增加，免疫熒光顯示Notch2的表達高度集中于平滑肌壁，與平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)共定位。但與對照組相比，心臟毛細血管密度無明顯差異，說明Notch2的促血管生成功能還有待進一步探究[23]。另有研究顯示，Notch2的激活不僅可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的增殖與凋亡，還可促進血管內(nèi)皮細胞生成細胞球蛋白，加強平滑肌細胞對一氧化氮的利用，進一步促進血管功能；Notch2也可能通過對血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的調(diào)節(jié)發(fā)揮心肌重構(gòu)抑制作用[24-25]。除了發(fā)揮保護作用，Notch2的表達還被證明可促進心肌纖維化的發(fā)生。Geng等[26]研究顯示，在高糖刺激的人主動脈瓣內(nèi)皮細胞中，相對于對照組細胞，Notch2的表達明顯上調(diào)，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加，纖維化標(biāo)志物如α-SMA、FN和波形蛋白等表達增加；而給予microRNA-18a-5p抑制Notch2的表達后，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化減少，纖維化標(biāo)志物減少。在糖尿病心肌病大鼠模型中，Notch2的表達抑制使內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及心肌纖維化減少，心功能好轉(zhuǎn)。由此說明，Notch2對于心肌重構(gòu)的作用可能存在兩面性，具體作用及機制還有待更進一步探究。

2.3 Notch3受體與心肌重構(gòu) 在離體大鼠心肌細胞中，Notch3被證明是Notch受體家族的主要表達受體，且在慢性心力衰竭模型中，Notch3的轉(zhuǎn)錄水平升高，且表達水平升高更為顯著[27]。Zhang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠I/R損傷模型中，Notch3可被腫瘤抑制素M激活，Notch3表達增加可減輕I/R造成的損傷，具體表現(xiàn)為Notch3激活組小鼠心肌損傷標(biāo)志物乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶明顯降低，心肌梗死面積減小，心臟射血分?jǐn)?shù)增加，心臟中ROS水平及線粒體中錳超氧化物歧化酶活性降低，心肌細胞凋亡減少。更為重要的是，Notch3減輕了I/R導(dǎo)致的小鼠線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，增加了其生物合成，主要通過提高小鼠缺血心肌線粒體ATP含量，增強檸檬酸合酶活性及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ的活性。細胞實驗進一步驗證了Notch3的上述作用，證明Notch3過表達可明顯緩解心肌重構(gòu)，相反地，抑制其表達會加重心肌重構(gòu)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Notch3的這一心臟保護作用是由PI3K/AKT通路介導(dǎo)的。另有研究顯示，Notch3可被apelin干預(yù)激活，進一步促進骨髓細胞的招募，抑制MI導(dǎo)致的小鼠心肌活性氧的生成增加及心肌細胞凋亡，增強心功能[29]。

Notch3還與心肌纖維化密切相關(guān)。在小鼠心肌梗死24 h后，Notch3表達迅速增加。與單純MI小鼠相比，過表達Notch3的小鼠心功能好轉(zhuǎn)，存活率升高，而沉默Notch3的小鼠心功能惡化，存活率降低。過表達Notch3可明顯抑制心臟內(nèi)纖維化標(biāo)志物α-SMA、Ⅰ型膠原、金屬蛋白酶組織抑制劑-2的轉(zhuǎn)錄和表達；且Notch3激活后p-Smad3表達降低。體外實驗中，過表達Notch3可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，同時也驗證了這一作用是通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路實現(xiàn)的[30]。施建麗[31]研究也顯示，Notch3可抑制心臟成纖維細胞增殖及向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，提示Notch3是通過抑制RhoA/ROCK/Hif1α軸發(fā)揮對抗心肌纖維化并改善心功能的。

另外，研究還發(fā)現(xiàn)Notch3與心臟血管生成密切相關(guān)。Ragot等[32]發(fā)現(xiàn)Notch3敲除的小鼠在基礎(chǔ)水平即表現(xiàn)出心肌肥厚和纖維化，加入血管緊張素2干預(yù)后，出現(xiàn)明顯的心力衰竭：心臟擴張，左心室短軸縮短率降低，心臟損傷標(biāo)志物表達升高。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因是，Notch3的敲除使心肌細胞及血管平滑肌細胞凋亡增加，纖維狀肌動蛋白水平下降，纖連蛋白增加，同時血管平滑肌細胞從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)變，血管生成減少。毛細血管稀疏引起心肌細胞的需求和供給不平衡，引起氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和纖維化。具體表現(xiàn)為心肌內(nèi)活性氧、還原型輔酶氧化酶Ⅱ、巨噬細胞浸潤、纖維化標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平(ColⅠ、ColⅢ、FN)均明顯增加。由此證明，Notch3還可通過調(diào)節(jié)血管生成對抗心肌重構(gòu)的發(fā)生。另一研究也顯示，小鼠MI模型中，Notch3可影響微血管的功能及成熟。相對于野生型小鼠，敲除Notch3小鼠的周細胞/毛細血管覆蓋率下降，小動脈成熟減少；雖然對心功能無明顯影響，但脈沖多普勒顯示左冠狀動脈舒張期峰值血流速度顯著降低，冠狀動脈血流儲備明顯下降。且Notch3敲除小鼠在結(jié)扎左冠狀動脈前降支后，引起心肌梗死面積更大、心功能更差、病死率更高。Notch3促進血管生成的作用是通過增加VEGF及血管生成素-1的表達發(fā)揮的，VEGF及Ang-1表達減少影響心肌缺血后小動脈的形成，使Notch3敲除小鼠平滑肌細胞覆蓋不規(guī)則，小動脈壁不完全，新生血管發(fā)育不成熟；更進一步導(dǎo)致心臟中炎性反應(yīng)和細胞凋亡的發(fā)生[33]。

另外，Xu等[34]發(fā)現(xiàn)在缺氧處理的H9C2細胞中，MicroRNA-1過表達可抑制Notch3激活，同時造成細胞凋亡增加，增殖和自噬減少；證明Notch3的激活可促進心肌細胞增殖和自噬，減少凋亡。也有研究顯示，Notch3的缺失會影響內(nèi)皮細胞與周細胞的通信，導(dǎo)致周細胞容易脫離并遷移到血管周圍間質(zhì)中分化為成纖維細胞，這一過程導(dǎo)致血管通透性增加，炎性反應(yīng)增加，心肌纖維化加重[35]，說明Notch3的表達還可能通過對維持周細胞的穩(wěn)定性發(fā)揮對抗心肌重構(gòu)的作用，但具體機制還有待進一步探究。

2.4 Notch4受體與心肌重構(gòu) 一項回歸分析顯示，Notch4基因中的T等位基因rs3134942可增加人群患擴張型心肌病的風(fēng)險[36]。在糖尿病合并心肌梗死的大鼠模型中，肌酸激酶同工酶、心肌肌鈣蛋白T水平升高，梗死面積增加，心肌細胞凋亡增加，同時，Notch1和Notch4的轉(zhuǎn)錄及表達水平被明顯抑制；在細胞水平激活Notch通路，使Notch1、Notch4表達增加，高糖及缺氧引起的心肌細胞存活率降低和凋亡增加均被明顯抑制[37]。由此證明，Notch4可通過抑制心肌細胞凋亡，對心肌重構(gòu)發(fā)揮一定的保護作用。另外，Notch4還被證明可被其配體DLL4調(diào)節(jié)，參與內(nèi)皮細胞與巨噬細胞的浸潤與分化，與心肌內(nèi)炎性反應(yīng)的形成密切相關(guān)[38]。由此證明，Notch4與血管內(nèi)皮細胞關(guān)系密切，可通過調(diào)節(jié)其增殖、遷移及凋亡，并參與內(nèi)皮細胞與其他細胞的相互作用，調(diào)節(jié)各種刺激下的心肌炎性反應(yīng)，抑制心肌重構(gòu)的發(fā)生。另外，Elmadhun等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在已構(gòu)建代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)的奧薩博豬中構(gòu)建慢性心肌缺血模型，結(jié)果顯示MS會抑制Notch4的表達，增加心肌細胞凋亡；但小動脈計數(shù)及毛細血管密度在MS組和對照組間無明顯差異，即Notch4的表達對血管生成無明顯影響。但與上述結(jié)果不同，James等[39]證明Notch4與小鼠發(fā)育過程中微血管叢的生成關(guān)系密切，但并未探究其對成年小鼠血管生成的作用；這可能是由于Notch4在不同階段的作用不同，有待進一步探究。

3 小 結(jié)

Notch受體家族作為心臟發(fā)育重要的成分，已被證明可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纖維化、促血管生成等多種方式調(diào)控心肌重構(gòu)的發(fā)生。雖大量研究顯示其在抑制心肌重構(gòu)中的積極作用，但也有研究顯示部分成員在不同疾病模型中發(fā)揮促進作用，且發(fā)揮作用的具體機制尚不十分清楚。Notch受體家族特異性激動劑或抑制劑的進一步使用仍需要進一步評估。因此深入探究Notch受體家族與心肌重構(gòu)的關(guān)系，探尋相關(guān)的分子作用機制，早日發(fā)現(xiàn)組織選擇性或靶基因選擇性的Notch激動劑或抑制劑對心血管疾病的防治具有深遠意義。