張璐 董振坤 綜述 崔巖 審校

液體活檢是以體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)游離DNA(Circulating free DNA，cfDNA)、循環(huán)游離RNA(Circulating free RNA，cfRNA)或外泌體(Exosomes，Exs)為基礎(chǔ)的新型檢測(cè)技術(shù)，因?yàn)槠淇梢宰鳛楸O(jiān)測(cè)泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤患者疾病狀態(tài)的潛在工具而備受關(guān)注。

ctDNA是存在于循環(huán)系統(tǒng)中來(lái)源于腫瘤的核酸片段，其主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的壞死、凋亡以及外泌體分泌。ctDNA作為液體活檢研究的熱點(diǎn)，在腫瘤的診斷、療效監(jiān)測(cè)及個(gè)體化治療方面均具有應(yīng)用價(jià)值。與傳統(tǒng)組織病理活檢相比，進(jìn)行ctDNA檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于創(chuàng)傷小、風(fēng)險(xiǎn)小，不僅可用于檢測(cè)基因突變，還可以進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)以監(jiān)測(cè)疾病的復(fù)發(fā)和隨著時(shí)間推移對(duì)治療的反應(yīng)。另外，檢測(cè)ctDNA可獲得腫瘤基因組信息，從病理學(xué)的角度來(lái)看，ctDNA更有可能代表整個(gè)腫瘤，減少傳統(tǒng)組織活檢異質(zhì)性的問(wèn)題，它還可以評(píng)估腫瘤基因表達(dá)的變化，并揭示耐藥的潛在機(jī)制[1]。

腎細(xì)胞癌(RCC)是腎臟最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2%～3%，且發(fā)病率逐年上升[2]。VHL抑癌基因是腎癌最常見(jiàn)的突變基因，另外，還存在PBRM1、SETD2、BAP1、KDM5C、TSC1、TSC2和MTOR等突變[3]，其中MTOR突變通常是功能性激活的，這可能是具有MTOR突變的患者對(duì)mTOR通路抑制劑有效的原因[4]。而PBRM1、SETD2、BAP1及KDM5C突變與不良預(yù)后相關(guān)[5]。以無(wú)創(chuàng)方式檢測(cè)這些基因改變，將改善腎細(xì)胞癌患者的臨床治療和生活質(zhì)量。本文結(jié)合ctDNA在腎細(xì)胞癌有關(guān)的最新進(jìn)展和面臨的問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 ctDNA在腎癌的檢測(cè)方法

液體活檢的基因組譜已被證明與相應(yīng)腫瘤的基因組譜非常相似[6]。然而，腎癌的ctDNA檢測(cè)與組織檢測(cè)有相當(dāng)大的不一致率，ctDNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展是解決ctDNA在腎癌中應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。ctDNA檢測(cè)方法在檢測(cè)血漿中ctDNA時(shí)的靈敏度取決于使用的檢測(cè)技術(shù)和平臺(tái)，同時(shí)也取決于腫瘤分期、腫瘤異質(zhì)性和腫瘤克隆性[7]。用于評(píng)估ctDNA的平臺(tái)可檢測(cè)不同數(shù)量的腎癌相關(guān)基因中不同類別的基因改變，包括單個(gè)核苷酸變體、插入突變、缺失突變和拷貝數(shù)擴(kuò)增等。基因檢測(cè)主要對(duì)DNA片段進(jìn)行實(shí)時(shí)或數(shù)字PCR檢測(cè)或高通量測(cè)序(Next generation sequencing，NGS)分析后，以識(shí)別基因改變、定量突變等位基因片段和基因拷貝數(shù)變異，不同的檢測(cè)方法可能有不同的檢測(cè)下限或不同的基因組區(qū)域。ctDNA檢測(cè)主要應(yīng)用于腎癌患者診斷和疾病的監(jiān)測(cè)，特別是在腎癌的治療和復(fù)查隨訪過(guò)程中，ctDNA發(fā)揮了其無(wú)創(chuàng)和可重復(fù)的優(yōu)勢(shì)。有研究通過(guò)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)腎細(xì)胞癌患者的ctDNA，發(fā)現(xiàn)當(dāng)腎癌復(fù)發(fā)時(shí)ctDNA水平明顯升高，這表明ctDNA是腎癌的潛在隨訪指標(biāo)，定期檢測(cè)ctDNA可以發(fā)現(xiàn)腎癌的進(jìn)展[8]。另外，研究表明ctDNA濃度隨分期增加而升高，在臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期惡性腫瘤患者中，ctDNA可檢出的比例分別為47%、55%、69%和82%[9]，ctDNA與腎癌的分期也有相關(guān)性，通過(guò)對(duì)不同分期的腎癌進(jìn)行ctDNA檢測(cè)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腎癌患者的ctDNA水平高于局限性腎癌患者，ctDNA在轉(zhuǎn)移性腎癌中檢出率也較高，因此ctDNA對(duì)腎癌分期具有價(jià)值。另外臨床研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤治療有效時(shí)，ctDNA水平會(huì)明顯降低，因此ctDNA也可以作為腎癌治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物[10]。另外ctDNA在瘤種方面存在差異，超過(guò)75%的胰腺、膀胱、結(jié)腸、乳腺、肝、胃轉(zhuǎn)移癌患者可檢測(cè)到ctDNA，而在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者中檢測(cè)到ctDNA要低于50%[9]。

2 ctDNA與腎癌組織檢測(cè)的一致性

雖然ctDNA來(lái)源于腎腫瘤，但ctDNA檢測(cè)和腎癌組織檢測(cè)還存在不一致性，Hahn等[11]通過(guò)比較NGS在腎腫瘤組織和ctDNA中檢測(cè)到的基因改變，發(fā)現(xiàn)腎腫瘤組織與ctDNA的基因改變數(shù)目無(wú)顯著性差異，但兩種檢測(cè)結(jié)果符合率僅為8.6%。Chae等[12]在28例晚期實(shí)體腫瘤患者中也獲得了類似的結(jié)果，在這兩種途徑檢測(cè)到的突變中，超過(guò)50%的突變是使用另一種檢測(cè)技術(shù)沒(méi)有檢測(cè)到的，這表明每種方法具有潛在的互補(bǔ)性。在Hahn等[11]研究中發(fā)現(xiàn)，19例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(Metastatic renal cell carcinoma，mRCC)患者均在基于組織的NGS檢測(cè)到基因突變，而在ctDNA的NGS分析中只有13例(68%)可以檢測(cè)到基因突變，6例患者在ctDNA的NGS檢測(cè)中未檢出基因突變。這些陰性患者包括轉(zhuǎn)移期檢測(cè)不到ctDNA的患者、檢測(cè)平臺(tái)未覆蓋的基因突變的患者或檢測(cè)錯(cuò)誤的樣本等情況。此外，在兩種檢測(cè)途徑中均檢測(cè)到基因突變的患者中，只有5例具有與基于組織的NGS相同的突變，均為T(mén)P53和VHL基因的突變。其中VHL是腎細(xì)胞癌的一種截短突變，其突變?cè)谒锌寺≈卸际潜Ｊ氐模?，VHL的符合率僅為50%。根據(jù)這些結(jié)果，在腎癌患者隨訪中僅通過(guò)一種基因特異性檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)的可能性很小。另外，需要不斷改進(jìn)ctDNA檢測(cè)技術(shù)，提高ctDNA與腎癌組織檢測(cè)的一致性。

3 ctDNA在腎癌的定性分析

腎癌轉(zhuǎn)移的時(shí)間和部位很難預(yù)測(cè)，這給監(jiān)測(cè)帶來(lái)了很大的難度，及早發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病可能會(huì)改善臨床預(yù)后。ctDNA可作為根治術(shù)后局限性腎癌患者的一種潛在的監(jiān)測(cè)標(biāo)志物。在一項(xiàng)對(duì)30例行腎切除術(shù)的RCC患者的研究中，ctDNA的NGS被用來(lái)檢測(cè)14個(gè)常見(jiàn)的突變基因，30例患者中有20例可檢測(cè)到基因突變，包括非同義突變、移碼突變、止損突變或剪接位點(diǎn)突變等。即使是疾病早期和腫瘤較小的患者也有可檢測(cè)到的ctDNA突變[13]。這表明，即使是局限性腎細(xì)胞癌的腫瘤負(fù)荷較低，也會(huì)釋放出可檢測(cè)到的ctDNA，因此ctDNA定性分析很重要。Pal等[14]對(duì)220例mRCC患者的ctDNA進(jìn)行了分析，79%的患者檢測(cè)出基因突變，其中最常見(jiàn)的是TP53(35%)、VHL(23%)、EGFR(17%)、NF1(16%)和ARID1A(12%)，以單核苷酸變異體和小的插入或缺失突變?yōu)橹?。研究還比較了在一線舒尼替尼和帕唑帕尼治療患者和二線納武單抗、依維莫司、阿昔替尼和卡博替尼治療患者的ctDNA分析中檢測(cè)到的基因突變，研究發(fā)現(xiàn)，在隨后接受二線治療的晚期治療組中，TP53(49%vs.24%，P=0.02)和NF1(20%vs.3%，P=0.01)的突變頻率更高。這些研究結(jié)果表明某些基因突變可能是由于治療的選擇性壓力而產(chǎn)生的，并可能在治療耐藥中發(fā)揮作用。

識(shí)別與腫瘤侵襲性相關(guān)的特定突變或一組突變，有助于應(yīng)用液體活檢指導(dǎo)mRCC的治療，腎透明細(xì)胞癌與SETD2、PBRM1、BAP1、KDM5C、MTOR等基因突變有關(guān)[15]。散發(fā)乳頭狀1型腎細(xì)胞癌與met基因突變有關(guān)，而散發(fā)乳頭狀2型腎細(xì)胞癌則與CDKN2A、SETD2、NF2、CUL3、TERT突變有關(guān)[16]。另外，在已知的與治療敏感性相關(guān)的分子通路中尋找特定的突變，有助于治療的選擇。依維莫司的敏感性與TSC1/TSC2/MTOR突變有關(guān)。在一項(xiàng)5例mRCC患者使用mTOR抑制劑治療的研究中，Voss等[17]在TSC1和MTOR兩個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了對(duì)mTOR信號(hào)有激活作用的基因突變，為治療反應(yīng)提供了合理的解釋。TSC1和TSC2可能被篩選為VEGF靶向治療進(jìn)展的RCC患者對(duì)依維莫司反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，有助于二線靶向治療藥物的選擇。

目前臨床主要開(kāi)展的腎癌ctDNA定性檢測(cè)除了基因突變，還包括DNA甲基化異常。ctDNA的CpG島甲基化在腎癌中普遍存在，可作為腎癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，APC基因的DNA超甲基化則與晚期腎癌分期有關(guān)[18]，已經(jīng)在腎癌患者的ctDNA中檢測(cè)到RASSF1A、FHIT和APC基因的CpG島的甲基化，多基因甲基化聯(lián)合分析的敏感度為62.9%，特異度為87.0%。此外，Jung等[19]檢測(cè)了腎癌組織中SHOX2 mRNA的表達(dá)，以及循環(huán)游離DNA中SHOX2基因的甲基化，研究表明組織和血漿中SHOX2甲基化與腫瘤分期和術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

4 腎癌ctDNA與cfDNA檢測(cè)的比較

cfDNA是指在體液(包括血液)中能檢測(cè)到的由凋亡或壞死的細(xì)胞釋放的不同長(zhǎng)度的游離核酸片段，在健康人群的血液和腫瘤患者體內(nèi)都可以檢測(cè)到[20]。在急性鈍性創(chuàng)傷、燒傷、膿毒癥、心肌梗死和惡性腫瘤患者中均可檢測(cè)到cfDNA水平升高[21-23]。而來(lái)源于腫瘤的ctDNA片段僅占總cfDNA的1.0%以下，從血漿中提取cfDNA及其定量方法并不能確定哪些DNA片段來(lái)自腫瘤細(xì)胞或來(lái)自壞死性炎癥過(guò)程，因此特異性不高。cfDNA主要以濃度檢測(cè)作定量分析，ctDNA主要以腫瘤基因特異性改變檢測(cè)作定性分析。需要高靈敏的檢測(cè)方法檢測(cè)cfDNA中的微量ctDNA，PCR檢測(cè)方法可以檢測(cè)到樣品中存在的單個(gè)靶分子，但不能檢測(cè)出ctDNA中存在的多基因的突變和更大的結(jié)構(gòu)變異。為此，高通量測(cè)序被用來(lái)測(cè)定cfDNA中腫瘤DNA。

cfDNA與ctDNA相比較診斷的特異性差，但cfDNA檢測(cè)技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，通常僅需要進(jìn)行定量分析，可以作為腎癌的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌患者血漿cfDNA水平明顯高于局限性腎透明細(xì)胞癌患者，cfDNA高的患者在腎癌根治術(shù)后的復(fù)發(fā)率明顯高于血漿cfDNA低的患者(P=0.018)[8]。另外，血漿中cfDNA的定量可以預(yù)測(cè)索拉非尼治療腎癌的療效，在6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)來(lái)分析mRCC患者接受索拉非尼治療后cfDNA濃度，與進(jìn)展期患者相比，緩解期或穩(wěn)定期患者的cfDNA水平顯著降低[24]。ctDNA與cfDNA在腎癌的疾病監(jiān)測(cè)過(guò)程中具有互補(bǔ)性，cfDNA檢測(cè)技術(shù)成熟且成本相對(duì)較低，可先行cfDNA的定量分析，當(dāng)cfDNA升高后進(jìn)一步行ctDNA定性檢測(cè)，通過(guò)ctDNA分析進(jìn)行指導(dǎo)治療。另外，有研究發(fā)現(xiàn)腎癌患者ctDNA陽(yáng)性時(shí)cfDNA高度片段化且小片段比例高，因此可以通過(guò)分析cfDNA的片段比例預(yù)測(cè)ctDNA，有效地指導(dǎo)ctDNA定性檢測(cè)[25]。

雖然液體活檢在臨床上應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但由于目前ctDNA檢測(cè)方法的局限性，某些情況下不能從這種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)中獲益，如腫瘤篩查和治療后微小殘留病灶的檢測(cè)，尤其是區(qū)分cfDNA和ctDNA需要高靈敏度的技術(shù)和低成本的檢測(cè)方法。為此，有學(xué)者基于免疫沉淀開(kāi)發(fā)了一種新型敏感檢測(cè)方法分析少量的cfDNA甲基化，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤特異性差異甲基化區(qū)域(DMRs)可以用一種低成本、高效率的方法檢測(cè)，進(jìn)而提高ctDNA檢測(cè)的靈敏度[26]，這為ctDNA檢測(cè)提供一個(gè)新的方向。

5 腎癌ctDNA與CTCs檢測(cè)的比較

CTCs是指游離在血液循環(huán)中的從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移病灶脫落的腫瘤細(xì)胞。CTCs檢測(cè)對(duì)于腎癌診斷、預(yù)后判斷、預(yù)測(cè)治療反應(yīng)和監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要臨床意義。游離核酸在循環(huán)中的半衰期為15分鐘至數(shù)小時(shí)，比細(xì)胞及RNA更穩(wěn)定，并且在技術(shù)上比CTCs更容易分離[27]。此外，ctDNA代表細(xì)胞池，可以讓我們深入了解腫瘤基因改變的所有組成部分以及亞克隆的數(shù)量和性質(zhì)。然而，在大多數(shù)情況下，ctDNA檢測(cè)需要先了解目標(biāo)靶標(biāo)，并且不是所有的DNA突變都會(huì)表達(dá)出來(lái)。ctDNA必須從大量的野生型cfDNA中分離出來(lái)，與腫瘤患者相比，在健康人中也可檢測(cè)到微量的cfDNA。作為監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的生物標(biāo)記物來(lái)說(shuō)，目前還不清楚腫瘤細(xì)胞是由于治療死亡或是對(duì)治療耐藥而形成ctDNA。細(xì)胞毒性化療誘導(dǎo)白細(xì)胞和紅細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致cfDNA釋放到血漿中，這也是一個(gè)潛在的干擾因素。另外，同樣值得關(guān)注是CTCs可以是凋亡的，也可以是存活的，但只有存活的CTCs才會(huì)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。

目前腎癌CTCs分離系統(tǒng)主要基于血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的物理差異的方法和免疫細(xì)胞角蛋白表達(dá)，如上皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。細(xì)胞角蛋白的表達(dá)水平存在偏差，當(dāng)腫瘤細(xì)胞如腎癌肉瘤樣變發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)時(shí)[28]，失去了細(xì)胞角蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致部分或完全轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型，因此在CTCs分析中無(wú)法檢測(cè)到。為了克服這種偏差，Ivonne等[29]開(kāi)發(fā)了一種基于多參數(shù)免疫熒光顯微鏡的CTCs檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)可以檢測(cè)EpCAM等上皮標(biāo)志物和具有間變和干細(xì)胞樣屬性的細(xì)胞。此外，針對(duì)腎細(xì)胞癌開(kāi)發(fā)了一種替代CTCs檢測(cè)抗原的新細(xì)胞表面標(biāo)記物組合，由CA9和CD147組成，與傳統(tǒng)的基于EpCAM的方法相比，其效率明顯提高[30]。雖然ctDNA檢測(cè)較CTCs有一定優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)單細(xì)胞功能測(cè)定、代謝產(chǎn)物分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析和RNA檢測(cè)只能通過(guò)CTCs來(lái)實(shí)現(xiàn)[31-32]，因此ctDNA和CTCs具有一定的互補(bǔ)性。

6 小結(jié)與展望

循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)是腎癌最具前景的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)。盡管通過(guò)腎癌組織活檢和ctDNA檢測(cè)都可以進(jìn)行標(biāo)志物的識(shí)別、預(yù)后的判斷和分子亞型的分類，但跟蹤克隆進(jìn)化演變、早期識(shí)別耐藥機(jī)制、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和殘留病變只有通過(guò)無(wú)創(chuàng)的ctDNA檢測(cè)才可能實(shí)現(xiàn)。目前腎癌的ctDNA檢測(cè)也面臨許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)，需要更深入的研究來(lái)推動(dòng)臨床應(yīng)用。更好地了解ctDNA釋放所涉及的機(jī)制，并采用綜合的多維分析方法，將是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵。