范琳 田霖麗 綜述 劉鳴 審校

自2009年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)問世以來，研究人員通過對(duì)單個(gè)細(xì)胞的遺傳信息進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)出個(gè)體細(xì)胞間的差異和他們?cè)谖h(huán)境中的相互作用機(jī)制及某一特定細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程。目前，頭頸部惡性腫瘤已經(jīng)成為癌癥相關(guān)疾病死亡的第六大病因，但基于免疫組化、解剖部位和腫瘤分期的腫瘤分類方法并沒有將腫瘤異質(zhì)性的因素考慮在內(nèi)，基于這種分類方式制定的臨床診療方案仍有待進(jìn)一步探索。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的開展，推動(dòng)研究人員對(duì)頭頸部惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制和個(gè)體化治療方案的制定進(jìn)行更全面、精確的研究。本文就單細(xì)胞測(cè)序在頭頸部惡性腫瘤中的研究進(jìn)展予以綜述，旨在探尋該技術(shù)在頭頸部惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究及診治方面可能帶來的重要變革。

1 單細(xì)胞測(cè)序概述

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是通過對(duì)分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行基因組的擴(kuò)增，從而進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序、分析和應(yīng)用。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)包括單細(xì)胞單組學(xué)分析和單細(xì)胞多組學(xué)分析，其中單細(xì)胞單組學(xué)分析包括基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表觀遺傳組測(cè)序和蛋白質(zhì)組測(cè)序[1]。單細(xì)胞基因組測(cè)序可以應(yīng)用于檢測(cè)基因組的穩(wěn)定性和基因組的變異[2]，從而為人類理解細(xì)胞的生理和病理功能提供新見解。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為描述腫瘤細(xì)胞的克隆多樣性和探究罕見細(xì)胞在腫瘤發(fā)展中的作用提供了強(qiáng)有力的新途徑[3]。表觀遺傳是指基因組和轉(zhuǎn)錄組以外可遺傳的信息，如DNA甲基化、RNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)的重塑和三維空間構(gòu)象等。單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測(cè)序技術(shù)的產(chǎn)生讓研究人員對(duì)表觀遺傳學(xué)的關(guān)鍵問題得以進(jìn)一步研究，如細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性是否與表觀遺傳異質(zhì)性有關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)了解單細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用十分重要。單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)的發(fā)明有助于探究基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳組的相互作用關(guān)系[4]。總之，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)使研究者能夠低成本、快速構(gòu)建器官或者組織的大規(guī)模單細(xì)胞表達(dá)圖譜，了解組織或器官內(nèi)細(xì)胞復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，以及單細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步探究各細(xì)胞群體的協(xié)同方式。

2 單細(xì)胞測(cè)序在頭頸部惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

2.1 揭示頭頸部惡性腫瘤的異質(zhì)性

頭頸部惡性腫瘤是全世界腫瘤死亡的重要原因。近年來，研究人員對(duì)頭頸部惡性腫瘤內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)有了很大的提高，但對(duì)這種異質(zhì)性如何影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的理解仍處于起步階段[5]，認(rèn)識(shí)這一過程對(duì)設(shè)計(jì)有效的頭頸部惡性腫瘤治療策略有著重大意義。Song等[6]第一次利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)繪制出喉鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的圖譜進(jìn)一步理解了喉癌的發(fā)生發(fā)展過程。頭頸部惡性腫瘤細(xì)胞相關(guān)的的缺氧、應(yīng)激、上皮分化和EMT表達(dá)程序在同一頭頸部惡性腫瘤內(nèi)部和不同頭頸部惡性腫瘤間都存在異質(zhì)性。Locasale等[7]三位研究人員在單細(xì)胞水平繪制頭頸部惡性腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞代謝基因表達(dá)譜，揭示了頭頸部惡性腫瘤的代謝異質(zhì)性。Mroz等[8]認(rèn)為等位基因腫瘤異質(zhì)性評(píng)分可以作為頭頸部腫瘤異質(zhì)性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)研究表明在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中，腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性與預(yù)后相關(guān)[9]。隨著研究人員對(duì)頭頸部惡性腫瘤異質(zhì)性認(rèn)識(shí)的加深，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)治療方案的制定也不斷的被質(zhì)疑。Rasmussen等[10]用腫瘤比例評(píng)分和聯(lián)合陽性評(píng)分研究PD-L1表達(dá)在頭頸部惡性腫瘤中的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用TPS評(píng)估PD-L1陽性率和CPS評(píng)估的PD-L1陽性率顯著不同[10]，這證明PD-L1作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療效果的預(yù)測(cè)標(biāo)記物不可靠。綜上所述，隨著對(duì)腫瘤異質(zhì)性研究的愈加深入，加深理解了頭頸部惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，推進(jìn)了頭頸部惡性腫瘤的個(gè)體化治療方案的制定。

2.2 描述頭頸部惡性腫瘤的微環(huán)境

口腔鱗狀細(xì)胞癌的單細(xì)胞測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，非腫瘤細(xì)胞按照細(xì)胞類型分為8大類：T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞，在頭頸部惡性腫瘤中非腫瘤細(xì)胞盡管比例不同，但他們的表達(dá)狀態(tài)和細(xì)胞類型一致。這些發(fā)現(xiàn)表明，針對(duì)間質(zhì)細(xì)胞或免疫細(xì)胞的治療(例如免疫檢查點(diǎn)抑制)可能適用于所有腫瘤，而針對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的靶向治療需要針對(duì)性策略。主要T細(xì)胞可分為四個(gè)亞群：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、常規(guī)CD4+T輔助細(xì)胞和兩個(gè)細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞群[11]。同其他亞群相比，細(xì)胞毒性亞群在共抑制受體(如PD1、CTLA4)表達(dá)上存在差異，CD8+T細(xì)胞群在不同的患者中也存在著顯著差異。這些T細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)可能為預(yù)測(cè)對(duì)檢查點(diǎn)免疫療法的反應(yīng)提供信息。

除了免疫細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)在腫瘤微環(huán)境中有著復(fù)雜的作用。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、腫瘤存活、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、免疫系統(tǒng)抑制和腫瘤侵襲有關(guān)[12]。研究人員用單細(xì)胞測(cè)序的方法區(qū)分出結(jié)直腸癌患者中的兩個(gè)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞群體，稱為CAF-A和CAF-B[13]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)同頭頸部惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞群體相似，CAF-A細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因，CAF-B細(xì)胞表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物(例如ACTA2、PDGFA)。未來的單細(xì)胞研究將繼續(xù)對(duì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞群體進(jìn)行亞型劃分，確定其不同的表達(dá)狀態(tài)，進(jìn)一步研究頭頸部惡性腫瘤中成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性對(duì)治療抵抗的影響。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還可以在研究某類細(xì)胞命運(yùn)決定中得以運(yùn)用。如Fillbin等[14]發(fā)現(xiàn)了在H3K2M突變型膠質(zhì)瘤中惡性特征最明顯的少突膠質(zhì)前體樣細(xì)胞亞群中的關(guān)鍵分子PDGFRA和BIM1(命運(yùn)決定點(diǎn))。這種發(fā)現(xiàn)對(duì)認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展十分重要。目前尚無單細(xì)胞測(cè)序在頭頸惡性腫瘤細(xì)胞命運(yùn)決定方面的研究，或許還可以根據(jù)這種突變基因研究出相關(guān)的靶向藥物，將腫瘤局限于早期，這些都是研究人員在未來期望看到的成果。

2.3 評(píng)估頭頸部惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是頭頸部惡性腫瘤患者死亡的重要原因。在之前的研究中，研究人員認(rèn)為上皮性腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)因子[15]。在對(duì)頭頸部惡性腫瘤及其淋巴結(jié)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)來自周圍腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)的TGF-β誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的p-EMT狀態(tài)，促進(jìn)對(duì)周圍組織的侵襲[16]。通過基于TCGA數(shù)據(jù)評(píng)估頭頸部惡性腫瘤細(xì)胞的部分上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)部分上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管侵襲和囊外浸潤有關(guān)，這表明惡性細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞一同向淋巴結(jié)擴(kuò)散并形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而不是單個(gè)惡性細(xì)胞外滲和植入淋巴結(jié)床，這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示可以利用免疫組織化學(xué)分析原發(fā)性腫瘤中的部分上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物，提高對(duì)隱匿性淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)。Puram等[11]對(duì)18例頭頸部惡性腫瘤患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，進(jìn)一步證實(shí)部分EMT可以作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，這種預(yù)測(cè)可以減少N0分期的頭頸部鱗癌中不必要的頸淋巴結(jié)清掃。同樣，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)侵襲(Perineural invasion，PNI)中的基因表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的功能狀態(tài)相關(guān)[17-18]，盡管核磁共振成像和F-氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描能夠評(píng)估頭頸部惡性腫瘤的PNI，但早期PNI很少被檢測(cè)到，這意味著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)程序可能作為早期PNI的預(yù)測(cè)因子。目前研究發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA是一種重要的生物標(biāo)志物，許多研究證實(shí)長非編碼RNA同頭頸部惡性腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化表達(dá)相關(guān)。Kolenda等[19]發(fā)現(xiàn)ZFAS1基因的表達(dá)影響頭頸部惡性腫瘤的部分上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)LINC00460通過PRDX1進(jìn)入細(xì)胞核而促進(jìn)頭頸部惡性腫瘤細(xì)胞的部分上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[20]。這些長非編碼RNA都可能成為頭頸部惡性腫瘤預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)和治療頭頸部惡性腫瘤的潛在靶點(diǎn)。

2.4 探究循環(huán)腫瘤細(xì)胞的作用

循環(huán)腫瘤細(xì)胞已經(jīng)成為臨床上有效的檢測(cè)腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的新工具。與原發(fā)性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞有新的體細(xì)胞變異，這增強(qiáng)了治療過程中癌細(xì)胞的逃逸性。在臨床中，通常很難對(duì)轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性腫瘤進(jìn)行活檢，而對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序可以在沒有活檢測(cè)序的情況下觀察到腫瘤譜中體細(xì)胞的變化。循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以檢測(cè)腫瘤的異質(zhì)性和推測(cè)腫瘤的進(jìn)化形態(tài)[21]。對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序可以幫助研究人員更全面的了解腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。而通過檢測(cè)到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞核苷酸突變而繪制出的腫瘤演化的早期突變圖譜具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞在腫瘤中的研究結(jié)果仍富有爭議，因?yàn)樵诖罅垦芯恐写嬖谘h(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)的原理、方法不同和研究方法缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的問題，導(dǎo)致判斷標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)結(jié)果存在較大差異，缺乏可比性[22]。在頭頸部惡性腫瘤中對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究剛剛處于起步階段，單細(xì)胞測(cè)序在這方面將有巨大的應(yīng)用潛力。期望在未來看到更多相關(guān)研究成果的出現(xiàn)。

2.5 評(píng)價(jià)治療效果和評(píng)估治療抵抗

盡管采用積極的多模式治療，仍有30%的頭頸部惡性腫瘤患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，60%的頭頸部惡性腫瘤患者會(huì)出現(xiàn)局部轉(zhuǎn)移[23]。對(duì)于難治性腫瘤，問題在于腫瘤細(xì)胞是否獲得了能夠生存的突變，或者是否始終存在一個(gè)通過選擇性治療壓力存活下來的細(xì)胞亞群。Kim等[24]應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序分析接受新輔助治療的三陰性乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)在治療耐藥的患者中存在治療耐藥基因型，而且這種基因型是在新輔助治療選擇下發(fā)生的。在整個(gè)治療過程中，基因組和轉(zhuǎn)錄組一直發(fā)生著變化，提示治療抵抗的適應(yīng)性和獲得性機(jī)制同時(shí)發(fā)生，目前尚無頭頸部惡性腫瘤在這方面的研究。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行頭頸惡性腫瘤治療抵抗相關(guān)方面的研究，將對(duì)頭頸惡性腫瘤治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

3 小結(jié)與展望

單細(xì)胞測(cè)序?qū)τ陬^頸部惡性腫瘤的研究意義重大。腫瘤異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)使研究人員不再將腫瘤的發(fā)生發(fā)展看作一個(gè)整體，而是不同成分之間的共表達(dá)的結(jié)果。對(duì)于微環(huán)境的研究揭示了病理和生理狀態(tài)下不同的細(xì)胞亞群和某類細(xì)胞中的細(xì)胞亞群。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的發(fā)現(xiàn)提供了潛在的預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，為臨床醫(yī)生對(duì)頭頸部惡性腫瘤患者做出早期有效的治療提供支持。單細(xì)胞測(cè)序在評(píng)價(jià)頭頸部惡性腫瘤治療效果和治療抵抗方面的應(yīng)用可能對(duì)頭頸部惡性腫瘤的治療帶來革命式的改變。單細(xì)胞測(cè)序更是促進(jìn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究發(fā)展，使研究人員能在提取的細(xì)胞數(shù)目有限的情況下全面的進(jìn)行遺傳信息分析。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)近期蓬勃發(fā)展，但其在頭頸部惡性腫瘤中的研究仍存在許多挑戰(zhàn)?；颉⒉±砗团R床表現(xiàn)三者之間的確定關(guān)系仍有待于進(jìn)一步研究。另外許多單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)具有患者特異性，這些數(shù)據(jù)是否適用于所有個(gè)體，這都是未來需要探究的問題。