張慧聰，周文翹，章婷婷，胡常紅

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院全口義齒診療室/口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，401147)

1 平衡狀態(tài)下的皮膚干細(xì)胞

皮膚損傷的修復(fù)需要一系列過(guò)程，包括止血、血管生成、再上皮化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑。這其中有許多皮膚干細(xì)胞的參與，包括毛囊間表皮干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、毛囊漏斗部細(xì)胞、皮脂腺導(dǎo)管細(xì)胞等。這些細(xì)胞在傷口發(fā)生時(shí)，可以轉(zhuǎn)變?yōu)楸砥じ杉?xì)胞，加速傷口的愈合并且促進(jìn)皮膚附屬器的再生。譜系分析表明，皮膚中的新生毛囊是來(lái)自于毛囊干細(xì)胞小生境之外的表皮細(xì)胞，即毛囊間表皮，這表明傷口中的表皮干細(xì)胞具有毛囊干細(xì)胞的表型。毛囊間表皮由單層增殖性基底細(xì)胞和數(shù)層分化的非增殖性細(xì)胞組成?；准?xì)胞可以作為終末分化的角質(zhì)形成細(xì)胞的補(bǔ)充細(xì)胞。在小鼠模型中，基底細(xì)胞遷移到皮膚表面大約需要1周的時(shí)間，而補(bǔ)充整個(gè)毛囊間表皮需要大約1個(gè)月的時(shí)間[1]。早期的增殖動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，毛囊間表皮是由包含干細(xì)胞和祖細(xì)胞的小增殖單位維持。毛囊間表皮穩(wěn)態(tài)是由一群定向祖細(xì)胞維持的，它們以隨機(jī)的方式平衡更新和分化[2,3]。但是，進(jìn)一步的研究表明毛囊間表皮干細(xì)胞可以維持更加靜止的狀態(tài)，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，并且可以產(chǎn)生循環(huán)更短，壽命更短的祖細(xì)胞[4]。

2 傷口愈合過(guò)成中的干細(xì)胞

皮膚組織具有替換凋亡細(xì)胞和治愈傷口的天然能力。這種能力存在于常駐干細(xì)胞當(dāng)中，它們會(huì)在皮膚表皮和其附屬器受到來(lái)自外部環(huán)境的日常襲擊時(shí)，保持穩(wěn)態(tài)并在受傷后進(jìn)行自我更新，保存和修復(fù)[5]。在傷口愈合過(guò)程中，干細(xì)胞被激活并向不同的皮膚區(qū)域遷移。在修復(fù)過(guò)程中皮膚干細(xì)胞會(huì)瞬時(shí)失去譜系限制和空間限制，從而允許多個(gè)表皮干細(xì)胞發(fā)揮作用[6]。

毛囊干細(xì)胞位于毛囊凸起處，受傷后，毛囊干細(xì)胞會(huì)從毛囊凸起處迅速遷移到傷口，這將有助于表皮的修復(fù)。稀薄的毛囊干細(xì)胞在傷口愈合過(guò)程中具有很高的可塑性，與其在移植后的最終結(jié)果相似[7]。但是Cotsarelis[8]等人在小鼠受傷前將毛囊干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后建立皮膚缺損模型，之后觀察到毛囊干細(xì)胞遷移到傷口中心，但這種現(xiàn)象并沒(méi)有持續(xù)存在，最終只有3%的新生毛囊是被標(biāo)記的。這說(shuō)明了非毛囊干細(xì)胞是新生毛囊的主要來(lái)源。為了進(jìn)一步研究再生毛囊的起源細(xì)胞，使用了Krt1-15-CrePR *;R26R轉(zhuǎn)基因小鼠，在受傷之前將大約70%的毛囊干細(xì)胞和50%的非毛囊凸起的表皮細(xì)胞標(biāo)記，受傷后，大約一半的再生毛囊擁有表達(dá)lacZ的細(xì)胞（非毛囊凸起的表皮細(xì)胞的標(biāo)記物），表明新的毛囊形成需要多種表皮細(xì)胞[8]。這些研究表明新的毛囊起源于毛囊干細(xì)胞生態(tài)位以外的細(xì)胞。

對(duì)毛囊間表皮干細(xì)胞的克隆分析表明，在小鼠尾巴皮膚損傷后，毛囊間表皮干細(xì)胞會(huì)被募集到傷口處，可以幫助表皮修復(fù)并持續(xù)長(zhǎng)達(dá)35天[4]。但是，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，毛囊間表皮干細(xì)胞群體僅在其起源區(qū)域長(zhǎng)期存在，而不會(huì)在傷口愈合過(guò)程中其所遷移到的位置長(zhǎng)期存在。這些觀察結(jié)果表明，在修復(fù)過(guò)程中，所有基底細(xì)胞均表現(xiàn)出一定程度的可塑性，基底細(xì)胞雖然可以在傷口發(fā)生時(shí)迅速遷移到傷口中心促進(jìn)傷口的愈合，但基底細(xì)胞最終會(huì)保留其原始位置的記憶，而長(zhǎng)期停留在原始位置。與毛囊干細(xì)胞相似，毛囊峽部表達(dá)Lrig1和Lgr6的干細(xì)胞在受傷后會(huì)動(dòng)員起來(lái)，并且可能比毛囊干細(xì)胞活化得更快。但毛囊干細(xì)胞在再生過(guò)程中會(huì)迅速丟失，僅用作瞬時(shí)繃帶，使毛囊間表皮和毛囊峽部/漏斗部中的其他干細(xì)胞能夠長(zhǎng)期維持修復(fù)狀態(tài)[9]。在表皮損傷后，來(lái)自凸起的干細(xì)胞被募集到表皮中，并以線性方式向傷口中心遷移，最終形成明顯的放射狀。值得注意的是，盡管凸起處的細(xì)胞也具有表皮表型，但多數(shù)在數(shù)周內(nèi)從表皮中清除，這表明凸起處的干細(xì)胞通過(guò)對(duì)急性傷口產(chǎn)生短時(shí)的“瞬時(shí)擴(kuò)增”效應(yīng)以應(yīng)對(duì)皮膚傷口的急性修復(fù)。無(wú)毛的皮膚（例如爪子的腹側(cè)或掌側(cè)）會(huì)比人的皮膚動(dòng)力學(xué)愈合發(fā)生的更慢，這表明毛囊干細(xì)胞對(duì)于傷口的愈合是必不可少的[10]?？偠灾?，由創(chuàng)傷所產(chǎn)生的皮膚缺損可廣泛激活干細(xì)胞，使其呈現(xiàn)出不同于其穩(wěn)態(tài)作用的特征。

3 傷口愈合過(guò)程中的干細(xì)胞的招募，遷移

通常表皮損傷后角質(zhì)形成細(xì)胞增殖增加。有趣的是，在傷口邊緣未觀察到細(xì)胞的增殖，而是在傷口周圍，距邊緣0.5-1.5 mm處的增生區(qū)處觀察到增殖[11,12]。在傷口的最前沿，角質(zhì)形成細(xì)胞不會(huì)增殖，而是以細(xì)胞片的形式遷移[11,12]。表皮細(xì)胞在受傷后12小時(shí)內(nèi)開(kāi)始遷移到傷口床中。受傷后的第二天，靠近傷口的毛囊間表皮細(xì)胞朝著傷口的方向呈細(xì)長(zhǎng)形，并且處于靜止?fàn)顟B(tài)，而遠(yuǎn)處的細(xì)胞開(kāi)始增殖。在這個(gè)區(qū)域之間，可以觀察到包含遷移細(xì)胞和增殖細(xì)胞的混合區(qū)域。在這個(gè)混合區(qū)域中，基底細(xì)胞向傷口拉長(zhǎng)，并在該方向定向分裂。在表皮中，最初存在于前緣的細(xì)胞會(huì)平行于傷口的方向而被拉長(zhǎng)，這表明細(xì)胞會(huì)主動(dòng)遷移，但在傷后2-4天呈垂直方向，這可能是因?yàn)樗鼈儽缓竺娴募?xì)胞推動(dòng)和壓縮[11]?？偠灾?，這些觀察結(jié)果提示，在受傷后的前沿首先會(huì)發(fā)生細(xì)胞遷移，接著該區(qū)域中的細(xì)胞移位會(huì)觸發(fā)細(xì)胞的定向分裂。細(xì)胞增殖的增加本身可以產(chǎn)生更多的遷移細(xì)胞，這些遷移細(xì)胞隨后將前沿推向傷口中心。

受傷后的第四天，前沿細(xì)胞被壓縮并上調(diào)促進(jìn)炎癥和再生的特定基因的表達(dá)。最前沿的細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)較高水平的基質(zhì)金屬蛋白酶，促炎分子，控制細(xì)胞骨架的基因，微管和肌動(dòng)蛋白，ECM配體和細(xì)胞粘附分子，例如整聯(lián)蛋白α5。前沿的恒定大小及其與傷口大小或皮膚區(qū)域的獨(dú)立性表明，控制標(biāo)記物的表達(dá)信號(hào)是局部的，并可能在表皮內(nèi)的細(xì)胞之間傳播。前沿可以充當(dāng)瞬時(shí)支架，實(shí)現(xiàn)和諧的傷口愈合。通過(guò)分泌更高水平的蛋白質(zhì)來(lái)控制ECM重塑和血凝塊溶解，傷口前沿可能會(huì)促進(jìn)組織的再生朝傷口中心發(fā)展，并保護(hù)干細(xì)胞及其后代免受組織重塑[13]。

4 干細(xì)胞的種群動(dòng)態(tài)

在穩(wěn)態(tài)過(guò)程中，毛囊間表皮細(xì)胞在種群水平上不對(duì)稱分裂，以維持恒定數(shù)量的表皮細(xì)胞[14]。然而，在傷口愈合期間，需要增加細(xì)胞數(shù)量以補(bǔ)償丟失的細(xì)胞，直到重新上皮化的完成。可以通過(guò)增加對(duì)稱性更新或減少細(xì)胞分化的比例來(lái)實(shí)現(xiàn)過(guò)度更新，而不是過(guò)度分化。對(duì)K14-CreER（毛囊間表皮細(xì)胞和祖細(xì)胞）和Lrig1-CreER（漏斗干細(xì)胞）小鼠品系的克隆分析表明，單個(gè)毛囊間表皮或漏斗細(xì)胞（基底層和基底層以上）產(chǎn)生的標(biāo)記細(xì)胞條紋向著傷口中心[11]。不管它們的最初位置如何，傷口似乎都能誘導(dǎo)少量干細(xì)胞的活化。

5 干細(xì)胞可塑性

當(dāng)來(lái)自毛囊和毛囊漏斗部的干細(xì)胞在受傷時(shí)被募集到毛囊間表皮時(shí)，它們逐漸失去其最初的特性，而被重新編程為毛囊間表皮干細(xì)胞的命運(yùn)[9]。然而造成這種可塑性的分子機(jī)制仍不完全清楚。在比較受傷的毛囊間表皮和穩(wěn)態(tài)中的毛囊干細(xì)胞和毛囊間表皮干細(xì)胞的染色質(zhì)分布時(shí)，受傷的毛囊間表皮在毛囊干細(xì)胞和毛囊間表皮干細(xì)胞之間表現(xiàn)出雜交特征，其中開(kāi)放的染色質(zhì)區(qū)域富含毛囊間表皮干細(xì)胞（Klf5）和毛囊干細(xì)胞（Sox9）轉(zhuǎn)錄因子。這個(gè)混合階段似乎確保了表皮屏障的正確重建[15]。這種混合狀態(tài)在修復(fù)過(guò)程中是短暫的，但在皮膚癌中持續(xù)存在的[15,16]。

受傷后分化的表皮細(xì)胞能夠恢復(fù)到干細(xì)胞狀態(tài)[17,18]，這在氣道上皮中也觀察到此類現(xiàn)象。但是，基底毛囊間表皮細(xì)胞的譜系追蹤表明，這些細(xì)胞在傷口愈合條件下不能再次回到基礎(chǔ)狀態(tài)[11,12]。相反，位于毛囊峽部的表達(dá)Gata6的細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)條件下會(huì)產(chǎn)生皮脂腺管，可在傷口愈合期間動(dòng)員并向受損的毛囊間表皮遷移，并從分化的干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛赘杉?xì)胞[19]。這種損傷不會(huì)在受傷后立即發(fā)生，因?yàn)榛准?xì)胞需要幾天的時(shí)間才能進(jìn)入基底層并進(jìn)行干細(xì)胞重編程[19]。與皮膚相似，腸道上皮中負(fù)責(zé)終末分化的細(xì)胞也可以恢復(fù)為祖細(xì)胞樣狀態(tài)，并在損傷后促進(jìn)組織修復(fù)[20]。但是，需要腸道干細(xì)胞來(lái)確保電離輻射后的組織修復(fù)[21]，這表明，盡管定向祖細(xì)胞具有恢復(fù)干細(xì)胞的能力，但正常的組織駐留干細(xì)胞對(duì)于修復(fù)仍然至關(guān)重要。

創(chuàng)傷程度還可以影響細(xì)胞的可塑性。在相對(duì)較小的傷口中，皮膚重新上皮化而沒(méi)有重新形成毛囊，而在大傷口中則明顯出現(xiàn)了重新發(fā)育的毛囊。譜系追蹤證實(shí)，這些重新發(fā)育的毛囊不是源自毛囊干細(xì)胞，而是源自毛囊間表皮細(xì)胞[13]。這類似于胚胎發(fā)育過(guò)程中毛囊的形態(tài)發(fā)生。

6 展 望

在過(guò)去的十年中，已將皮膚傷口愈合的重點(diǎn)放在了細(xì)胞療法上，包括將各種細(xì)胞和生物活性因子摻入到支架中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)完整的組織再生。關(guān)于傷口愈合還應(yīng)致力于借助尖端技術(shù)和分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑的知識(shí)，進(jìn)一步激勵(lì)研究人員將來(lái)開(kāi)發(fā)有效的傷口護(hù)理療法。最近出現(xiàn)的新技術(shù)展現(xiàn)了傷口特異性治療方法的新途徑和策略。各種基因編輯工具，材料科學(xué)工程學(xué)和跨學(xué)科科學(xué)的共同努力，對(duì)改變當(dāng)前情況具有巨大潛力。隨著生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的新技術(shù)發(fā)展，皮膚再生和修復(fù)的持續(xù)改進(jìn)正在以更快的速度進(jìn)行。再生醫(yī)學(xué)及其相關(guān)臨床研究的未來(lái)趨勢(shì)可能會(huì)為新的治療方法打開(kāi)大門，這可能會(huì)帶來(lái)傷口的無(wú)痛，快速和無(wú)疤愈合。