紀(jì)雷 紀(jì)道林，2 鮑冬冬 綜述 譚剛 校審

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性腫瘤，約占所有肝癌的75%，是癌癥相關(guān)死亡的第2大常見原因[1]。全球每年約有80萬例HCC新發(fā)病例，約占癌癥總數(shù)的5.6%[2]。據(jù)統(tǒng)計有超過75%的HCC病例發(fā)生在亞洲地區(qū)，其中中國占全球所有病例的一半以上[3]。HCC不僅惡性程度高，且浸潤和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，3年生存率為12.7%[4]，5年生存率僅為10%[5]。隨著醫(yī)療技術(shù)和基礎(chǔ)研究的發(fā)展，人們對疾病的認(rèn)識不斷加深，全球醫(yī)學(xué)界認(rèn)識到HCC的耐藥是影響療效的瓶頸，是亟待解決的大問題。因此，了解HCC耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制至關(guān)重要。

索拉非尼(Sorafenib)作為一種口服激酶抑制劑，是全球公認(rèn)的肝癌一線靶向藥物[6]。該藥的作用機(jī)制主要是通過阻斷生長因子VEGF、PDGF和c-Kit等多種酪氨酸受體激酶，從而抑制Raf/MEK/ERK等介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯示其抗腫瘤活性。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，起初認(rèn)為是大量轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，生物學(xué)意義較低。后來發(fā)現(xiàn)lncRNA能夠參與疾病發(fā)生發(fā)展，且可作為多種腫瘤的抑癌因子和致癌驅(qū)動因子，參與調(diào)控相關(guān)信號通路，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展[7]。有研究表明lncRNA在HCC中對索拉菲尼的耐藥起著正向或負(fù)向的調(diào)控作用。因此，揭示lncRNA在HCC化療耐藥中的調(diào)控機(jī)制，為尋找新的分子治療靶點(diǎn)、完善治療方案以及提高預(yù)后發(fā)揮重要的作用。

1 lncRNA與HCC

lncRNA作為一類與調(diào)控表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后多層面等相關(guān)的重要因子，正越來越受到科學(xué)家關(guān)注。lncRNA異常表達(dá)和突變與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)[8-9]。此外，lncRNA在某些類型的癌癥中特異性表達(dá)，并在循環(huán)血液或尿液中檢測到[10]。例如Panzitt等[11]發(fā)現(xiàn)lncRNA HULC在HCC患者的腫瘤和血漿中均上調(diào)，是HCC的潛在生物標(biāo)志物。隨著深入研究，如今lncRNA也可以作為一類新型的潛在靶點(diǎn)用于HCC的治療。

2 lncRNA與索拉非尼耐藥性

作為HCC一線靶向治療藥物，索拉非尼單藥療效并不理想，中位生存期約為3～5個月[12]。此外，常伴有多種藥物相關(guān)的化療副作用，如皮疹，腹瀉，血壓升高等，并且極易發(fā)生耐藥。其中耐藥是治療失敗的主要原因，這嚴(yán)重影響了患者的長期生存。lncRNA的異常表達(dá)與HCC耐藥密切相關(guān)[13]，被認(rèn)為能通過調(diào)節(jié)多種分子機(jī)制在耐藥中起著重要作用，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號通路、監(jiān)測腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)功能、調(diào)節(jié)啟動子甲基化程度等。此外，lncRNA可通過競爭miRNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄，調(diào)控miRNA的活性，間接在耐藥中發(fā)揮重要作用[14]，這種lncRNA被稱為競爭性內(nèi)源RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)，也稱為lncRNA海綿。如今，越來越多與索拉非尼耐藥性相關(guān)的新型lncRNA被發(fā)掘，我們必須更加深入了解調(diào)控耐藥的機(jī)制，才能為最終克服肝癌耐藥性開辟更多潛在的途徑。

3 HCC索拉菲尼耐藥相關(guān)的lncRNA

3.1 已具備調(diào)控機(jī)制的lncRNA

3.1.1 長基因間非蛋白編碼RNA 8(Long intergenic non-protein coding RNA 8，H19) lncRNA H19(2.7 kb)是最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，是母系表達(dá)的父系印跡基因，位于人染色體11p15.5區(qū)域附近。到目前為止，越來越多的研究顯示，H19上調(diào)了許多與腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移相關(guān)的基因表達(dá)，并可通過多種機(jī)制影響腫瘤的進(jìn)程。如Jv等[15]證實了抑制H19和miR-675的表達(dá)進(jìn)而通過AKT/GSK-3β/Cdc25A信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Ma等[16]發(fā)現(xiàn)H19通過調(diào)節(jié)miR-193a-3p/PSEN1軸促使HCC細(xì)胞對化療藥物(多西他賽、紫杉醇、長春瑞濱、5-FU)敏感。此外，有研究顯示H19的表達(dá)一方面受表觀遺傳的影響，另一方面也受到其啟動子甲基化程度的明顯調(diào)控[17]。Schultheiss等[18]證實了索拉菲尼耐藥性的產(chǎn)生與H19的表達(dá)顯著下降密切相關(guān)，且所有耐藥細(xì)胞系中均表現(xiàn)出了顯著的H19啟動子高度甲基化。同時，高表達(dá)H19后索拉菲尼治療敏感性明顯增強(qiáng)，調(diào)控藥物敏感性主要是通過抑制細(xì)胞增殖能力，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。然而，目前關(guān)于H19啟動子高甲基化以及能否作為ceRNA對索拉菲尼耐藥性影響的研究較少，但恢復(fù)H19作用可能成為未來克服HCC治療中索拉菲尼耐藥的潛在靶點(diǎn)。

3.1.2 睪丸相關(guān)的高度保守的致癌長鏈非編碼RNA(Testis-associated highly conserved oncogenic long non-coding RNA，THOR)THOR最初是測定人類轉(zhuǎn)錄組中超級保守的lncRNA中發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，位于人2號染色體[19]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)THOR在黑色素瘤、肝癌、腎癌等腫瘤中廣泛表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。Cheng等[20]發(fā)現(xiàn)THOR可能通過增強(qiáng)PTEN/AKT信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。在索拉菲尼耐藥的研究中，他們發(fā)現(xiàn)肝臟CSCs中顯示出THOR的表達(dá)顯著增加，敲減THOR能降低肝CSCs的自我更新能力，抑制肝臟CSCs擴(kuò)增，提高肝癌細(xì)胞對索拉非尼化療的敏感性[21]。β-catenin信號通路能夠促進(jìn)肝臟CSCs的激活，參與化療耐藥[22]，且在應(yīng)用β-catenin抑制劑FH535后，敲除THOR的HCC細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，消除了肝CSCs比例的差異和自我更新能力的差異[20]，進(jìn)一步說明β-catenin是THOR調(diào)節(jié)肝CSCs擴(kuò)增的關(guān)鍵下游通路?？偟膩碚f，THOR可能通過調(diào)控β-catenin信號通路，促進(jìn)肝臟CSCs擴(kuò)增及索拉菲尼化療耐藥性。

3.1.3 lncRNA ARSR(Activated in RCC with Sunitinib Resistance) lncRNA ARSR是一種新型非編碼RNA，位于人9號染色體上，由4個全長591 nt的外顯子組成[23]。在耐藥的研究中，Li等[24]通過實驗證實上調(diào)ARSR可調(diào)控p10-pi3k/Akt通路促進(jìn)肝癌對阿霉素的耐藥。在HCC索拉菲尼耐藥研究中，Yang等[25]發(fā)現(xiàn)在肝臟CSCs中顯示出ARSR的表達(dá)顯著增加，下調(diào)ARSR表達(dá)能夠抑制肝臟CSCs的擴(kuò)增。接下來，他們在索拉菲尼處理的肝癌細(xì)胞系中下調(diào)ARSR表達(dá)，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞對索拉非尼敏感性明顯增加，意味低水平的ARSR患者受益于索拉非尼治療，進(jìn)一步證實了STAT3是ARSR的下游靶基因。說明lncRNA ARSR通過調(diào)控STAT3信號通路，促進(jìn)肝臟CSCs擴(kuò)增及索拉菲尼化療耐藥性。

3.1.4 組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)相關(guān)長鏈非編碼RNA(Highly expressed in hepatocellular carcinoma，HEIH) lncRNA HEIH是一種功能性非編碼RNA，位于人染色體5q35.3上。最初是在鑒定乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)相關(guān)HCC的lncRNA譜中發(fā)現(xiàn)的一種高表達(dá)水平的lncRNA，并證明HEIH具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用[26]。Ma等[27]證實在肝癌細(xì)胞中，敲減HEIH后miR-199a-3p表達(dá)量明顯上調(diào)，同時腫瘤惡性生物學(xué)行為受到了明顯抑制，說明lncRNA HEIH能夠作為ceRNA在肝癌中發(fā)揮重要作用。Shen等[28]發(fā)現(xiàn)在耐藥HCC組織和細(xì)胞系中HEIH的表達(dá)明顯升高，并在小鼠異種移植模型中升高，證實下調(diào)HEIH可顯著增強(qiáng)索拉非尼介導(dǎo)的腫瘤生長抑制作用。接下來他們通過StarBase在線軟件程序，搜索與HEIH互補(bǔ)堿基配對的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-98-5p中包含HEIH結(jié)合位點(diǎn)，用雙熒光素酶報告和RNA免疫沉淀法證實了HEIH與miR-98-5p的相互作用，HEIH沉默能夠促進(jìn)耐藥細(xì)胞中miR-98-5p的表達(dá)，說明HEIH與miR-98-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，敲低HEIH可通過調(diào)控miR-98-5p增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對索拉非尼的敏感性。PI3K/AKT通路作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路，其激活與HCC對索拉非尼的獲得性耐藥有關(guān)[29]。因此進(jìn)一步驗證miR-98-5p對索拉非尼耐藥的影響是否由PI3K/AKT通路介導(dǎo)，分別單用PI3K抑制劑(WM)、anti-miR-98-5p 以及WM+anti-miR-98-5p處理耐藥細(xì)胞系，顯示W(wǎng)M處理降低了PI3K和AKT水平，此外WM處理還減輕了miR-98-5p抑制(anti-miR-98-5p 處理)誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞中PI3K和AKT水平的升高，表明miR-98-5p抑制激活了索拉非尼耐藥細(xì)胞中PI3K/AKT通路。功能實驗也發(fā)現(xiàn)miR-98-5p抑制可通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥，而WM可逆轉(zhuǎn)這個促進(jìn)作用。說明miR-98-5p抑制可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的激活，增強(qiáng)了索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥。此外，Western blot分析還顯示，HEIH缺失降低了索拉菲尼耐藥肝癌胞癌中PI3K和AKT的表達(dá)，而抑制miR-98-5p后這種降低作用被減弱[28]，說明HEIH可競爭性結(jié)合miR-98-5p，調(diào)控PI3K/AKT通路，從而增強(qiáng)索拉非尼化療耐藥性。

3.1.5 HCC相關(guān)長鏈非編碼RNA(Hepatocellular carcinoma-associated long non-coding RNA，HANR) lncRNA HANR是一種在HCC中特異性表達(dá)的非編碼RNA，Xiao等[30]發(fā)現(xiàn)HANR沉默可調(diào)控GSKIP/GSK3信號通路抑制HCC增殖，增強(qiáng)阿霉素的化療敏感性。Shi等[31-32]首先發(fā)現(xiàn)HANR能夠通過ceRNA機(jī)制，促進(jìn)HCC進(jìn)展。在索拉菲尼耐藥細(xì)胞中，HANR的表達(dá)水平明顯升高，且HANR高表達(dá)后顯著增強(qiáng)了細(xì)胞對索拉非尼治療的抗藥性，同時自噬相關(guān)蛋白比例明顯升高，細(xì)胞凋亡也明顯減少，說明HANR通過誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)HCC索拉非尼耐藥。接著通過軟件分析發(fā)現(xiàn)HANR可以與miR-29b形成互補(bǔ)堿基配對，miR-29b作為miR-29家族的一員，其作為腫瘤抑制因子已被充分證明，且有報道稱miR-29在調(diào)控自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用[33]。結(jié)合上述結(jié)論，研究人員提出假設(shè)HANR能夠作為miR-29b的ceRNA，調(diào)控HCC的自噬和化療耐藥性，并通過實驗證實miR-29b是HANR的靶基因，miR-29b通過抑制耐藥細(xì)胞的自噬而削弱HANR介導(dǎo)的索拉非尼耐藥。隨后使用雙熒光素酶報告證實miR-29b與ATG9A之間能夠相互作用，ATG9A可做為miR-29b的下游靶點(diǎn)，促進(jìn)索拉非尼耐藥細(xì)胞的自噬。因此分析得出HANR能夠競爭性結(jié)合miR-29b，調(diào)控ATG9A的表達(dá)，促進(jìn)自噬相關(guān)的索拉非尼化療耐藥性。

3.1.6 核寄生組裝轉(zhuǎn)錄本1(Nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1) lncRNA NEAT1位于人染色體11q13.1上，存在兩個變體，即NEAT1_1(3.7 kb)和NEAT1_2(23 kb)。有報道稱NEAT1參與癌癥的化療耐藥性[34-35]。此外，最近的研究表明，NEAT1可能參與ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[36]。在HCC索拉菲尼耐藥性的研究中，Kessler等[37]發(fā)現(xiàn)在索拉非尼耐藥細(xì)胞中NEAT1的表達(dá)顯著升高。Niu等[38]發(fā)現(xiàn)NEAT1在HCC中的表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移、索拉非尼耐藥密切相關(guān)，與NEAT1高表達(dá)組相比，NEAT1低表達(dá)組的患者表現(xiàn)出更長的總生存期。隨后通過使用在線軟件程序Starbase，發(fā)現(xiàn)NEAT1與miR-149-5p形成互補(bǔ)堿基配對，并通過雙熒光素酶報告驗證了NEAT1與miR-149-5p的結(jié)合位點(diǎn)，證實miR-149-5p是NEAT1的直接靶點(diǎn)。AKT1是一種在許多癌細(xì)胞中過度活躍的原癌基因，有報告表明，AKT1降低了癌細(xì)胞對索拉非尼的敏感性[39]。因此通過實時PCR檢測NEAT1、miR-149-5p和AKT1三者在索拉菲尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平，分析顯示miR-149-5p與NEAT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，AKT1與NEAT1表達(dá)呈正相關(guān)[38]。說明NEAT1可通過競爭性結(jié)合miR-149-5p，調(diào)控AKT1的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC對索拉非尼的耐藥。我們期望進(jìn)一步研究NEAT1/miR-149-5p/AKT1通路治療的理想方案(劑量、頻率、給藥方法)，將是最終臨床應(yīng)用這一發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵步驟。

3.2 未具備調(diào)控機(jī)制的lncRNA

HNF4A-AS1是肝細(xì)胞核因子HNF4A衍生的一種lncRNA，是一種反義lncRNA，位于HNF4A的上游。lncRNA AL109659.2則隸屬于SLC5A9的反義，Wu等[40]發(fā)現(xiàn)HNF4A-AS1和AL109659.2在索拉菲尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)升高，且都顯著增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對索拉非尼的耐藥。Song等[41]通過大數(shù)據(jù)分析，鑒定HNF4A-AS1可作為潛在的ceRNA，在HCC中發(fā)揮作用，但是否在耐藥中發(fā)揮作用尚未明確。Guo等[42]證實SNHG16在HCC中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)SNHG16表達(dá)后能夠逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥。目前為止，仍然還有許多l(xiāng)ncRNA在HCC及索拉菲尼耐藥中的生物學(xué)功能未被發(fā)掘，有必要進(jìn)一步探索。

4 小結(jié)與展望

越來越多的lncRNA被證實與HCC的進(jìn)展和化療耐藥密切相關(guān)，目前已知lncRNA能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號通路、肝CSCs擴(kuò)增、啟動子高甲基化等途徑，在HCC化療耐藥性中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，某些lncRNA能夠作為miRNA海綿，在化療耐藥中發(fā)揮作用。隨著芯片技術(shù)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，大量lncRNA在HCC中被發(fā)現(xiàn)，但僅有一小部分lncRNA得到了功能表征，而且一些特異性lncRNA與HCC耐藥關(guān)系的研究，多數(shù)僅報道過一次。毫無疑問，需要進(jìn)行大量的研究去揭示這些 lncRNA在HCC化療耐藥性中的實際功能，一方面要不斷地去發(fā)掘新的與HCC及耐藥相關(guān)的lncRNA，這對于提示HCC耐藥的發(fā)生有重要意義；另一方面繼續(xù)研究未被表征的lncRNA如HNF4A-AS1和AL109659.2是通過何種途徑來影響HCC耐藥。同時，lncRNA/miRNA/circRNA在肝癌耐藥中的調(diào)控軸值得我們進(jìn)一步研究，以揭示不同種類的耐藥相關(guān)lncRNA之間復(fù)雜的相互作用。更為重要的是，把基礎(chǔ)研究真正的融入臨床實踐中去，要把評估以lncRNA為靶點(diǎn)的治療策略在HCC耐藥中的可行性、安全性和有效性作為重中之重，進(jìn)行多次、大量的臨床試驗以期將這種治療方案盡早投入臨床應(yīng)用。眾所周知，lncRNA在HCC的癌變和發(fā)展中的作用是廣泛而多樣的，在肝癌化療耐藥中也涉及復(fù)雜的作用機(jī)制，因此，有必要充分了解HCC進(jìn)展的分子過程和化療耐藥性，以確定合適的lncRNA作為治療靶點(diǎn)，進(jìn)而改善HCC預(yù)后。