趙 霞,馬躍軍,劉 斌,吳鐵成,高玉林,李玉榮,烏蘭其其格,蘇雅拉圖,烏仁圖亞
(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;2.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000;3.赤峰市巴林左旗烏蘭達(dá)壩蘇木動(dòng)物防疫站,內(nèi)蒙古 巴林左旗 025463;4.赤峰市巴林左旗畜牧工作站,內(nèi)蒙古 巴林左旗
025450)
利用冷凍精液對(duì)家畜進(jìn)行人工授精時(shí), 由于輸精方法不同,受胎率存在顯著差異。特別是對(duì)綿羊、山羊進(jìn)行人工輸精時(shí),情期受胎率低的問題仍然沒有得到有效解決。 母羊子宮頸結(jié)構(gòu)特殊[1-2]以及缺乏有效的人工授精方法是造成受胎率低的主要原因。母羊子宮頸內(nèi)輸精越深,到達(dá)受精位點(diǎn)的精子數(shù)量越多,受精率和受胎率越高[3]。 腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精是20 世紀(jì)80 年代應(yīng)用于綿羊的一種有效人工繁殖技術(shù), 是利用冷凍精液進(jìn)行人工輸精的首選技術(shù)之一[4]。 使用常規(guī)輸精方法時(shí),利用冷凍保存的公羊精液對(duì)母羊進(jìn)行人工授精,母羊受胎率往往較低, 主要原因是操作人員對(duì)輸精深度和時(shí)間把握不準(zhǔn)確。為此,筆者以蒙古羊?yàn)檠芯繉?duì)象,通過比較冷凍精液不同人工授精方法(常規(guī)輸精法、 過子宮頸輸精法以及腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精法)對(duì)母羊受胎率的影響,確定最佳輸精深度和時(shí)間, 為提高母羊冷凍精液人工授精受胎率提供技術(shù)參考。
1.1.1 采精種公羊的選擇及飼養(yǎng)管理選擇3~5歲、體況健康的種公羊進(jìn)行精液采集。 種公羊入選標(biāo)準(zhǔn)為生殖系統(tǒng)發(fā)育正常,兩側(cè)睪丸勻稱,性欲旺盛,精液品質(zhì)良好。 于采精前30~40 d 飼喂種公羊配種期專用日糧,期間逐漸增加專用日糧的比例,直至完全替換。種公羊每天保持2 km 以上的運(yùn)動(dòng)距離,使其保持旺盛的新陳代謝和性欲機(jī)能,以生產(chǎn)品質(zhì)良好的精液。 試驗(yàn)期間種公羊每天采精1~2 次。
1.1.2 受體母羊的選擇及飼養(yǎng)管理選擇健康無病、發(fā)育良好、具有正常繁殖能力、膘情中等以上的蒙古羊母羊作為受體。 配種前30~40 d 根據(jù)母羊體況進(jìn)行分群飼養(yǎng),給予適當(dāng)?shù)亩唐趦?yōu)飼,增加優(yōu)質(zhì)干草和混合精料的飼喂量,以增強(qiáng)母羊體質(zhì)。
葡萄糖、檸檬酸鈉、三羥基氨基甲烷(Tris)、青霉素、鏈霉素、雙蒸水、甘油、國(guó)產(chǎn)孕酮海綿栓、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、靜松靈、蘇醒靈、酒精、碘酒等。 羊用胚胎移植手術(shù)架(自制)、過頸輸精器(自制)、子宮角輸精器、腹腔鏡、持針器、手術(shù)刀、手術(shù)用剪刀、外科縫合針及線、注射器、碘酒、酒精、新潔爾滅等。
吸管冷凍精液,每支精液量0.5 mL,含有效精子數(shù)7 000 萬個(gè),活率0.35 以上。 輸精前抽檢20支吸管精液,對(duì)精子活力、呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)量、存活時(shí)間、畸形率、頂體完整率、細(xì)菌菌落數(shù)、病原生物等指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn),均符合標(biāo)準(zhǔn)。
經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母羊, 在發(fā)情后不同時(shí)間使用3 種方法進(jìn)行冷凍精液輸精: 常規(guī)輸精法、過子宮頸輸精法、腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精法,過子宮頸輸精法包括過子宮頸第一皺褶(1~2 cm)輸精和過子宮頸第二到第三皺褶(3~4 cm)輸精。每種輸精方法分3 組,不同輸精方法的輸精時(shí)間、分組情況及受體母羊數(shù)見表1。
表1 不同輸精方法受體母羊分組及數(shù)量 單位:只
1.4.1 常規(guī)輸精法受體母羊統(tǒng)一采用孕酮海綿栓進(jìn)行同期發(fā)情處理。 在埋置孕酮海綿栓后的第14 天撤栓,同時(shí)肌肉注射PMSG 250 IU/只。 對(duì)通過試情挑選出的穩(wěn)定接受公羊爬跨的受體母羊進(jìn)行2 次輸精,母羊發(fā)情后約14 h 和22 h 各輸精1次。 第1 次輸精時(shí), 上午發(fā)情的母羊下午輸精1次,下午發(fā)情的母羊隔日上午輸精1 次。第2 次輸精時(shí)(第1 次輸精后約8 h)嚴(yán)格檢查母羊陰道黏液變化, 當(dāng)黏液稠而略帶黃色、 不結(jié)塊時(shí)進(jìn)行輸精。 將開膣器插入陰道,找到子宮頸口進(jìn)行輸精。
1.4.2 過子宮頸輸精法發(fā)情后的母羊術(shù)前空腹12 h 以上,只飲水不喂飼草料。手術(shù)時(shí)將母羊保定在特制的手術(shù)架上,使其呈仰臥姿勢(shì),抬高母羊后軀,使外陰與地面呈80°~90°角。 在母羊發(fā)情后約14 h 和22 h 各輸精1 次。 借助特制的帶有光源的開膣器固定子宮頸口,用特制的輸精針(17G)輕輕扎入子宮頸,并操縱輸精針通過子宮頸皺褶,將冷凍精液送到合適位置,并記錄輸精深度。
1.4.3 腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精法發(fā)情后的母羊術(shù)前空腹12 h 以上, 在母羊發(fā)情后30~36 h 輸精1 次。 借助腹腔內(nèi)窺鏡,采用套管針穿刺方法,將冷凍精液直接輸入發(fā)情母羊子宮角。
輸精后的母羊每天補(bǔ)飼優(yōu)質(zhì)干草、青干草、青貯飼料,妊娠后期適量補(bǔ)充精飼料、微量元素等。輸精后40 d 用B 超儀檢測(cè)母羊妊娠情況,計(jì)算受體母羊受胎率。
采用單因素方差分析法 (One-Way ANOVA)對(duì)接受不同輸精方法處理的受體母羊受胎率進(jìn)行方差分析, 應(yīng)用Etukey-Kramer 檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05 表示差異顯著。
由表2 可知, 腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精法的受體母羊受胎率平均值最高,為60.2%;其次為過子宮頸第二到第三皺褶(3~4 cm)輸精,受體母羊受胎率平均值為58.3%;過子宮頸第一皺褶(1~2 cm)輸精和常規(guī)輸精法的受體母羊受胎率平均值相近,分別為37.5%和36.3%。
表2 不同輸精深度和時(shí)間對(duì)受體母羊冷凍精液受胎率的影響 單位:%
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明, 腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精法和過子宮頸第二到第三皺褶(3~4 cm)輸精的受體母羊受胎率平均值顯著(P<0.05)高于常規(guī)輸精法和過子宮頸第一皺褶(1~2 cm)輸精;過子宮頸第二到第三皺褶(3~4 cm)輸精的受體母羊受胎率平均值與腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精法差異不顯著(P>0.05), 常規(guī)輸精法的受體母羊受胎率平均值與過子宮頸第一皺褶 (1~2 cm) 輸精差異不顯著(P>0.05)。
當(dāng)前, 羊精液冷凍保存技術(shù)的成熟度與牛精液相比還有很大差距, 羊冷凍精液解凍后的精子存活率不穩(wěn)定,一般不超過50%[5],這是導(dǎo)致使用冷凍精液對(duì)母羊進(jìn)行人工授精受胎率不高的原因之一。 羊冷凍精液保存過程中的關(guān)鍵問題是減少降溫過程對(duì)精子造成的損傷。 不同動(dòng)物精子對(duì)降溫的敏感程度不同, 而羊精子對(duì)低溫環(huán)境更加敏感。目前,雖然卵黃等保護(hù)性物質(zhì)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于羊冷凍精液的保存技術(shù)研究[6],但在實(shí)際生產(chǎn)中還存在很大程度的局限性。因此,應(yīng)尋求更好的保護(hù)劑提高羊精液在冷凍保存過程中的精子存活率,以提高母羊人工授精受胎率。
動(dòng)物排卵行為發(fā)生在發(fā)情期結(jié)束前后,因此,人工授精應(yīng)在排卵前進(jìn)行,以便排卵時(shí)在受精部位壺腹部聚集大量精子。一般情況下,對(duì)母畜每天早晚各試情1 次,上午發(fā)情的動(dòng)物應(yīng)在晚上(發(fā)情后10~12 h)進(jìn)行授精,晚上發(fā)情的動(dòng)物應(yīng)在次日上午(發(fā)情后14 h)進(jìn)行授精。 2 次授精可有效保障受體母畜受胎率。 授精時(shí)間應(yīng)根據(jù)使用的是新鮮精液還是冷凍精液輸精進(jìn)行調(diào)整。對(duì)羊來說,利用新鮮精液輸精時(shí), 精液在母羊生殖道內(nèi)沉積時(shí)間最好不超過24 h,而利用冷凍精液輸精時(shí),精液在母羊生殖道內(nèi)的存留時(shí)間不應(yīng)超過12 h。 由于冷凍后再解凍的精子壽命較短, 所以當(dāng)母羊排卵時(shí),2 次(間隔8~10 h 輸精1 次)輸精可能會(huì)在受精部位提供大量的活精子,有利于提高受胎率。
母羊子宮頸結(jié)構(gòu)特殊,與括約肌類似,向后突入陰道,具有很厚的壁和一條狹窄的管腔。反芻動(dòng)物子宮頸的凸起結(jié)構(gòu)形成橫的或螺旋形的嵴,進(jìn)而形成輪狀環(huán),互相契合將子宮頸嚴(yán)密封鎖。這些輪狀環(huán)結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致母羊受胎率低的主要原因之一[1-2,7-8]。 在子宮頸不完全穿通時(shí),部分或全部精液會(huì)回流到陰道內(nèi), 而陰道內(nèi)的酸堿度對(duì)精子存活不利;在子宮頸中段穿刺術(shù)中,精子幾乎都在子宮頸環(huán)部位,無法進(jìn)入子宮,這是常規(guī)輸精和過子宮頸第一皺褶輸精受胎率低的原因。 在完全穿刺子宮頸手術(shù)中,精液直接進(jìn)入子宮,離受精位點(diǎn)非常近,有利于受孕[9-10]。 但子宮頸管穿透深度受子宮頸管解剖結(jié)構(gòu)的影響。 子宮頸內(nèi)腔皺褶少或無皺褶的子宮頸具有較好的收縮性,較容易通過。子宮頸口到子宮頸前兩個(gè)皺褶被證明是限制子宮頸穿透性的主要因素。
過子宮頸輸精是將輸精槍頭插入子宮頸口進(jìn)行人工授精的一種方法[4]。 不同動(dòng)物子宮頸管長(zhǎng)度、彎曲度和可穿透性差異較大,品種、年齡、產(chǎn)羔史等因素可影響輸精器的穿透深度[11]。 該研究結(jié)果表明,采用過子宮頸輸精法對(duì)受體母羊輸精,當(dāng)授精深度接近4 cm 時(shí)才能達(dá)到與腹腔鏡輔助子宮內(nèi)輸精法接近的受胎率, 同時(shí)獲得比常規(guī)輸精法更高的受胎率。
腹腔鏡輔助人工輸精雖然已成為一種有效的人工授精方法,但其實(shí)際上是一種微創(chuàng)手術(shù)。在操作過程中,母羊在手術(shù)架上停留的時(shí)間較長(zhǎng),當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模腹腔鏡輔助人工授精時(shí), 存在耗時(shí)、耗力、影響母羊受胎率的問題。該技術(shù)用到的腹腔內(nèi)窺鏡成本較高, 其設(shè)備和勞動(dòng)力投入比過子宮頸輸精法更大, 同時(shí)要求技術(shù)人員具有較高的操作水平和熟練程度。 這些因素限制了腹腔鏡輔助人工輸精技術(shù)在生產(chǎn)中的大范圍推廣。此外,從保障動(dòng)物福利的角度考慮, 應(yīng)盡可能減少創(chuàng)傷性人工授精對(duì)母羊機(jī)體健康產(chǎn)生的負(fù)面影響。因此,研發(fā)更加便捷、 高效的非創(chuàng)傷性輸精方法是未來羊人工授精技術(shù)發(fā)展的方向。