姜雪瑩，錢英紅，趙俊利，張 凱，段 艷，李培鋒，何秀玲，毛 偉，曹金山，郭文瑞

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病診療技術(shù)重點實驗室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031 ）

動物膽汁在臨床疾病治療中被廣泛應用，最重要的活性成分之一是膽汁酸類化合物， 膽汁中膽汁酸類成分在動物體內(nèi)發(fā)揮護眼、護肝、調(diào)節(jié)腸胃功能、抗癌、抗炎、止咳、平喘、平衡血糖以及保護神經(jīng)等藥理作用［1］。 牛磺鵝去氧膽 酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）是動物膽汁中主要有效成分之一，化學名稱為3α，7α-二羥基-5β-24-膽烷酰-N-?；撬?，由鵝去氧膽酸（3α，7α-二羥基-5β-膽烷酸，CDCA）的羥基與?；撬幔?-氨基乙磺酸，Tau） 的氨基之間縮水而成的結(jié)合型膽汁酸［2-3］。 前期研究發(fā)現(xiàn)，劑量為0.1 g/（kg·BW）和0.2 g/（kg·BW） 的TCDCA 均能夠降低SO2誘發(fā)的小鼠咳嗽模型氣管和肺組織中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的分泌［3］。 同時，研究還發(fā)現(xiàn)TCDCA 能夠通過抑制小鼠血清和氣管組織中NO 含量，促進氣管組織中cAMP 的產(chǎn)生，降低SO2誘發(fā)的呼吸道炎癥部位中PGE2的分泌，進而發(fā)揮鎮(zhèn)咳、平喘等作用［4］。 Arndt 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，TCDCA能夠?qū)π∧c炎癥產(chǎn)生緩解作用， 在吲哚美辛誘導發(fā)生的急、慢性小腸炎癥反應中TCDCA 還能夠顯著抑制白細胞在炎癥反應發(fā)生部位的聚集和游走。 TCDCA 劑量為［0.1、0.2 g/（kg·BW）］時對由甲醛（5%）、角叉菜膠（1%）引發(fā)的大鼠炎性反應中局部組織的PGE2含量均有顯著抑制作用。國外學者Nguyen 等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟竇狀隙上皮細胞cAMP 生成的過程中，TCDCA 具有顯著的促進作用。 由此可知，TCDCA 對機體炎癥反應發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。

成纖維樣滑膜細胞 （fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）關(guān)節(jié)組織中具有重要作用的細胞。 FLS 的大量增生以及在關(guān)節(jié)滑膜部位的重新分布是發(fā)生RA 特征性病變的主要表現(xiàn)之一。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)， 在RA 發(fā)病過程中成纖維細胞的增殖優(yōu)勢是與非疾病相關(guān)組織的成纖維細胞的重要不同點。 通過體外分離培養(yǎng)FLS 的研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者的FLS 主要發(fā)生細胞增殖速度和遷移能力明顯增強，同時細胞形態(tài)具有多樣性等生物學特性變化。當分離培養(yǎng)的FLS 在多種因素的刺激下， 細胞因子（如IL-1β 等）和金屬基質(zhì)蛋白酶的分泌、表達和活性均有所提高， 促使炎癥和自身免疫反應發(fā)生［7-9］。 Liu 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）誘導的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型中，引發(fā)的大鼠足跖腫脹（包括原發(fā)性和繼發(fā)性）均能夠由TCDCA產(chǎn)生不同程度的抑制效應。由以上研究結(jié)果可知，TCDCA 均能在由物理性、化學性和細菌性因素引起的急、 慢性炎癥發(fā)生過程中發(fā)揮明顯的抑制作用。 為了進一步探究在AA 模型大鼠急、慢性炎癥反應過程中TCDCA 的作用機制，該研究以AA 模型大鼠FLS 為研究對象，采用ELISA 方法檢測了TCDCA 和IL-1β 作用下AA 大鼠FLS 上清液中PGE2的含量，分析了TCDCA 對IL-1β 刺激下AA模型大鼠FLS 中PGE2分泌情況的影響，進一步揭示動物機體內(nèi)源性物質(zhì)TCDCA 的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實驗動物該試驗選用的Wistar 大鼠均購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物研究中心， 動物合格證號為SCXK-（軍）2007-004， 選取大鼠體重為（160±20）g。

1.1.2 試劑TCDCA 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院獸醫(yī)藥理學課題組從雞膽汁中提取和純化，純度為98.6%；醫(yī)用卡介苗（BCG）購自寶生物工程（大連）有限公司；PGE2ELISA 檢測試劑盒購自美國Cayman 公司；IL-1β （批號：I2393）、 地塞米松（批號：50-02-2）均購自美國Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 主要儀器設備低溫高速離心機 （Sigma-3-30K）；多功能酶標儀（Synergy 4，美國Bio-Tek）；超凈工作臺（AIRTECH）；37 ℃搖床；CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）。

1.2 佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立

選擇Wistar 大鼠12 只飼養(yǎng)1 周，使其熟悉環(huán)境，以減少應激的產(chǎn)生。根據(jù)該試驗需要隨機分為正常對照組和AA 模型組，每組6 只大鼠。 根據(jù)參考文獻［11］中的方法制備完全弗氏佐劑（CFA），正常對照組不予處理，AA 模型組則需左后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL 制備好的CFA 以復制AA 大鼠模型。

1.3 模型的評價

AA 大鼠模型復制后18～21 d， 觀察各組大鼠的雙側(cè)足關(guān)節(jié)、足爪以及尾部的主要病變。

1.4 AA 大鼠成纖維樣滑膜細胞的體外培養(yǎng)及生物學特征的鑒定

1.4.1 滑膜組織的采集急性處死大鼠后， 將大鼠放于75%酒精中浸泡2～3 min，根據(jù)文獻［11-12］中的方法采集滑膜組織，用于后期細胞分離培養(yǎng)。每只大鼠應盡可能多收集雙側(cè)滑膜組織， 收集量為10～20 mg。

1.4.2 成纖維樣滑膜細胞的分離與培養(yǎng)采用文獻［12-13］中的方法，提取建立成功的AA 模型大鼠成纖維樣滑膜細胞進行分離、培養(yǎng)和傳代，用于后續(xù)試驗。

1.5 分組與給藥

根據(jù)試驗設計要求，將該試驗分為4 組，即空白對照組（AA 大鼠成纖維樣滑膜細胞，簡稱FLS，下同）；IL-1β 刺激組：FLS+ IL-1β （10 ng/μL）；TCDCA 作用組：FLS+IL-1β （10 ng/μL）＋TCDCA（10-4mol/L）；地塞米松組：FLS+IL-1β（10 ng/μL）+地塞米松（500 nmol/L）。

1.6 細胞懸液的制備

將經(jīng)組織塊貼壁法分離得到的單個滑膜細胞用含有10 ng/μL IL-1β 的DMEM 培養(yǎng)液配制成濃度為5×108cells/L 滑膜細胞懸液， 加入24 孔培養(yǎng)板， 每孔1 mL， 于37 ℃、5%CO2中作用48 h后，取細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，按照分組用無菌離心管離心，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min 去除細胞碎片，輕輕吸取上清液，放入1.5 mL 新的無菌Eppendorf 管，封蓋、編號后保存在-70 ℃冰箱中待測。

1.7 TCDCA 對IL-1β 刺激下AA 大鼠成纖維樣滑膜細胞中PGE2 分泌的影響

采用ELISA 方法，按照Cayman 公司PGE2檢測試劑盒說明書進行PGE2含量的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 AA 大鼠的鑒定

由圖1 可知，在AA 模型組大鼠造模后18～21 d，與空白對照組（見圖1a）比較，AA 模型組大鼠在腕部及掌部出現(xiàn)紅腫， 并且腫脹明顯 （見圖1b），證明AA 大鼠模型制備完成。

圖1 空白對照組與AA 模型組大鼠腕部及掌部對比

2.2 成纖維樣滑膜細胞的光鏡觀察

由圖2a 可知，在組織周邊有細胞長出，分離及培養(yǎng)的細胞形態(tài)較為均一、 呈長梭狀并伸出突起，局部仍分布少量圓形細胞。傳代后第5 天即在瓶底稠密分布，較前期生長更快，形態(tài)更均一，第7 天可予以再次傳代。 傳代細胞形態(tài)見圖2b。

圖2 成纖維樣滑膜細胞光鏡觀察（100×）

2.3 PGE2 含量的檢測

采用ELISA 方法檢測AA 大鼠FLS 上清液中PGE2含量，PGE2的標準曲線 見圖3。 由圖3 和OriginLab Origin V8.0 軟件處理數(shù)據(jù)結(jié)果可知，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。

圖3 PGE2 標準曲線

由圖4 可知，與空白對照組相比，IL-1β 刺激組、TCDCA 作用組、 地塞米松組AA 大鼠FLS 中PGE2的分泌量均顯著（P<0.05）升高；與IL-1β 組相比，TCDCA 作用組和地塞米松組均能夠顯著（P<0.05） 抑 制AA 大 鼠FLS 中PGE2的 分 泌。TCDCA 對AA 大鼠FLS PGE2的分泌呈現(xiàn)抑制作用。 TCDCA 在10-4mol/L 濃度時， 能夠顯著抑制IL-1β 刺激AA 大鼠FLS PGE2的分泌。

圖4 TCDCA 對IL-1β 刺激下AA大鼠FLS PGE2 分泌量的影響

3 討論

前列腺素（prostaglandins，PGs）是類花生酸家族的成員，可以由體內(nèi)幾乎所有的細胞產(chǎn)生。PGE2是一種具有廣泛生物學效應的脂質(zhì)， 作為前列腺素類化合物中的成員， 是二十碳飽和脂肪酸形成的花生四烯酸通過一系列酶催化反應形成的產(chǎn)物，對免疫細胞具有明顯抑制作用。 PGE2是一種重要的脂質(zhì)介質(zhì)， 可在機體的所有類型細胞中表達，在機體炎癥和發(fā)熱的病理生理過程中，引發(fā)炎性細胞趨化運動，聚集在炎性反應部位，擴張毛細血管使其通透性增加，促進炎性細胞滲出，繼而引起發(fā)熱及炎癥介質(zhì)IL－1β 的含量增加， 催化爆發(fā)式炎癥級聯(lián)反應，進而放大炎癥反應，導致發(fā)生炎癥和發(fā)熱的部位和組織PGE2的含量增加，在炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用［14-16］，研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥和免疫反應發(fā)生的過程中，TCDCA 可通過對糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導的信號通路在基因組學水平上引發(fā)激活效應， 進而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 同時研究結(jié)果還表明，GR 受體能夠被TCDCA 激活，啟動了基因組學和非基因組學的調(diào)控作用， 從而促進了抗炎相關(guān)因子脂皮素-1（lipocortin-1，LC-1）的表達。目前，LC-1 已被公認為糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）參與抗炎反應的重要調(diào)控因子［16］。 磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2） 重要的內(nèi)源性抑制劑為LC-1，是介導GCs 發(fā)揮抗炎作用的重要因子。 在炎性介質(zhì)合成釋放過程中，PLA2 為關(guān)鍵的影響因素， 同時也是炎性反應調(diào)節(jié)的中心。 花生四烯酸的產(chǎn)生過程中，PLA2 激活后作用在膜磷脂上起促進作用，花生四烯酸在一系列合成酶的作用下生成炎性介質(zhì)PGE2。 另一項研究還發(fā)現(xiàn)， 白介素-1β （interleukin 1 beta，IL-1β） 能夠刺激FLS 進而產(chǎn)生活化效應［17］。 在IL-1β 刺激FLS 過程中，環(huán)加氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達量升高，提高了PGE2的合成分泌水平。 TCDCA 能夠促進FLS 細胞中GR 受體的激活， 降低血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1） 的表達量，這一抑制效應可能與TCDCA 增強LC-1 的表達，降低COX-2 產(chǎn)生，以及抑制cPLA2 的表達量有關(guān)［18-19］。 COX-2 是COX 兩種同工酶中的一種， 作為COX-2 下游重要的影響合成因子mPGES-1。在PGE2合成過程中，mPGES-1 為這一合成反應中的最后一個催化酶， 在高表達炎癥因子IL-1β、TNF-α 等的條件下其催化作用能夠被提高，從而促進PGE2的合成，分泌量提高［20-21］。

研究結(jié)果顯示，TCDCA 能夠顯著抑制IL-1β刺激下AA 大鼠成纖維樣滑膜細胞中PGE2的分泌。綜上所述，TCDCA 能夠增強GR 介導的基因組學轉(zhuǎn)錄激活效應，抑制AA 大鼠炎癥介質(zhì)PGE2的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。 這一結(jié)果與TCDCA 能在動物機體炎性組織中減少一氧化氮（NO）、PGE2以及白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）等的含量，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用一致［10］。