匡 衡，蔡 欣綜述，汪茂榮審校

0 引 言

鼠疫是鼠疫耶爾森菌引起的一種嚴(yán)重的人畜共患傳染性疾病，在我國屬于甲類傳染病。人類歷史上有記載的流行出現(xiàn)過3次，造成了數(shù)億人的死亡。第3次鼠疫流行開始于18世紀(jì)，并持續(xù)至今[1]。近幾年來，鼠疫疫情時(shí)有爆發(fā)，2017年8月馬達(dá)加斯加鼠疫疫情爆發(fā)，感染者高達(dá)數(shù)千人，其中大部分為肺鼠疫。2019年11月12日北京確診2例肺鼠疫病例，11月15日內(nèi)蒙古確診1例腺鼠疫病例。2020年7月5日，內(nèi)蒙古1名牧民確診為腺鼠疫，8月2日包頭市發(fā)現(xiàn)1例死亡病例，經(jīng)會診確診為腸型鼠疫，死亡原因?yàn)檠h(huán)系統(tǒng)衰竭；8月6日包頭市發(fā)現(xiàn)一起腺鼠疫病例，患者于8月7日凌晨死亡。目前，鼠疫治療以鏈霉素為主的抗生素進(jìn)行治療，但近年來發(fā)現(xiàn)鼠疫耐藥菌甚至是多重耐藥菌，加之恐怖分子可利用耐藥鼠疫耶爾森菌制作生物武器，對人類造成生命威脅，因此，鼠疫疫苗的研發(fā)與臨床應(yīng)用顯得尤為迫切。早在19世紀(jì)末，Alexandre Yersin在香港發(fā)現(xiàn)了鼠疫耶爾森菌，并在數(shù)年后研制出了第一劑鼠疫疫苗[2]。目前為止，鼠疫疫苗的種類主要有減毒活疫苗、亞單位疫苗、結(jié)合疫苗和DNA疫苗等，但由于安全和保護(hù)效力問題，國內(nèi)僅有少數(shù)疫苗上市。本文就鼠疫疫苗的研發(fā)情況作一綜述。

1 減毒活疫苗

目前國內(nèi)上市的鼠疫疫苗大多為EV76減毒活疫苗，EV76是1926年從馬達(dá)加斯加獲得的鼠疫菌株，經(jīng)過數(shù)年培養(yǎng)后減弱了毒性，并投入臨床使用。在對EV76菌株不斷培育和傳代中，人們發(fā)現(xiàn)pyrE基因是EV76菌株的一個突變熱點(diǎn)，這可能對研發(fā)新型EV76疫苗有所幫助[3]。脂質(zhì)A是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的疏水性錨點(diǎn)，是LPS的毒性和生物學(xué)活性的主要組分，LPS通過細(xì)胞表面的TLR4通路激活細(xì)胞。而鼠疫耶爾森菌在37℃下合成一種TLR4通路無法識別的四?；|(zhì)A，以此來逃避先天免疫反應(yīng)，在低溫下，lpxP表達(dá)，生成六?；|(zhì)A，激活TLR4通路[4]。Sun等[5]將大腸桿菌lpxP基因?qū)胧笠咭疇柹旧w中，以免由于細(xì)菌丟失質(zhì)粒導(dǎo)致毒性，構(gòu)建了χ10015菌株，使其毒力大大降低。Χ10030菌株是將△Pcrp21::TT araC PBAD crp突變導(dǎo)入χ10015菌株得到，接種小鼠后誘導(dǎo)了高水平的IL-10，并在動物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了其比χ10015菌株更強(qiáng)的免疫原性和更低的毒性。2020年，Wang等[6]從KIM10(pKD46)中去除質(zhì)粒pKD46，得到Y(jié)PS19菌株，再在YPS19上引入DlacI::Plpp lpxE突變，得到Y(jié)PS20菌株。YPS20比YPS19極大降低了毒性，但YPS20的脂質(zhì)A去磷酸化失去了在pgm位點(diǎn)上調(diào)毒力因子的能力，導(dǎo)致YPS20肌內(nèi)注射不能為小鼠提供任何保護(hù)。因此，合成六?；|(zhì)A的YPS19菌株具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。

LcrV蛋白是一種鼠疫耶爾氏菌抗原，作為一種多功能蛋白質(zhì)，通過與負(fù)調(diào)控因子LcrG結(jié)合，并與YopB和YopD一起，影響效應(yīng)子的分泌并進(jìn)入真核細(xì)胞。LcrV也可作為鼠疫桿菌分泌系統(tǒng)的針帽蛋白與n -甲酰肽結(jié)合[7]。LcrV具有高度的免疫原性，可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，升高IL-10，降低腫瘤壞死因子α，是許多疫苗的重要組成部分[8]。重組減毒沙門氏菌RASV，由Branger等[9]于2009年構(gòu)建，RASV合成了LcrV的截?cái)嘈问健狶crV196。在動物實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)使用RASV可為小鼠提供完全的保護(hù)，可能是由于RASV產(chǎn)生免疫原性交叉保護(hù)抗原，而LcrV的保護(hù)作用并不顯著。在2016年，Sanapala等[10]優(yōu)化了(RASV) Χ12094，使小鼠口服后產(chǎn)生高水平LcrV, Psn和F1抗體，對皮下及鼻內(nèi)接種鼠疫桿菌的小鼠起到完全保護(hù)作用，而且未觀察到對小鼠的毒性作用。這種基于RASV的三價(jià)疫苗可進(jìn)一步研究其對人體的安全性及免疫能力，經(jīng)過臨床驗(yàn)證后未來有望成為下一代鼠疫疫苗。

2015年，van Lier等[11]通過高通量標(biāo)記誘變法獲得了50 088個鼠疫耶爾森菌株C092的突變體，并在肺鼠疫小鼠模型中用野生型鼠疫桿菌CO92進(jìn)行篩選，獲得了Δlpp ΔmsbB Δail和Δlpp ΔmsbB::ailL2兩株突變體，Δlpp ΔmsbB Δail突變株刪除了編碼基因LPP，乙酰轉(zhuǎn)移酶MsbB和附著入侵位點(diǎn)Ail的基因，而Δlpp ΔmsbB::ailL2包含毒性減弱的Ail基因。Tiner等[12]檢測了這兩株突變體，并新建了突變體Δlpp ΔmsbB Δpla，Δlpp ΔmsbB Δpla未刪除Ail而是刪除了纖溶酶原活化蛋白酶(plasminogen activating protease，pla)基因，在小鼠肺鼠疫模型中，接受Δlpp ΔmsbB Δail和Δlpp ΔmsbB Δpla免疫的小鼠均有80%～100%的存活率，分別接種兩種疫苗的大鼠也均獲得長期的體液和細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。由于Δlpp ΔmsbB Δail突變體被美國疾病防控中心排除在預(yù)防選擇代理列表外，Δlpp ΔmsbB Δpla突變株可能成為鼠疫疫苗的重點(diǎn)研究對象，而Δlpp ΔmsbB Δail突變體也并非無研究價(jià)值。

2 亞單位疫苗

亞單位疫苗相對減毒活疫苗要有更高的安全度。Leary等[13]將表達(dá)鼠疫F1與V抗原的基因融合并連接入pUC18中，得到的質(zhì)粒可表達(dá)F1與V抗原的融合蛋白。在小鼠動物實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)應(yīng)用融合蛋白和F1與V抗原聯(lián)用的保護(hù)作用相似，但明顯優(yōu)于單獨(dú)使用Fl或V抗原的保護(hù)效果。F1-V亞單位疫苗通常使用鋁制凝膠作為佐劑，這種佐劑通常誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞2(helper T lymphocytes 2，Th2)調(diào)節(jié)的體液免疫，在免疫效果方面不如體液免疫與細(xì)胞免疫的同時(shí)保護(hù)[14]。Dinc等[15]發(fā)現(xiàn)了一種新型佐劑SA-4-1BBL，該佐劑促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和干擾素(Interferon，IFN)，增加了Th1誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在皮下接種鼠疫桿菌的小鼠模型中，接種SA-4-1BBL連用鋁制凝膠作為佐劑的F1-V亞單位疫苗的保護(hù)效果要優(yōu)于使用單一佐劑的疫苗。但在肺鼠疫小鼠模型中，盡管SA-4-1BBL增加了細(xì)胞免疫的產(chǎn)生，但對雄鼠未產(chǎn)生更好的保護(hù)效果，因此SA-4-1BBL增加免疫療效的結(jié)論仍有待商榷。SA-4-1BBL強(qiáng)大的刺激細(xì)胞免疫效果不僅可使用在F1-V亞單位疫苗上，對其他亞單位疫苗，尤其是針對細(xì)胞內(nèi)病原體的疫苗可能更有效果。在開發(fā)F1-V亞單位疫苗上，新型佐劑的研發(fā)可能尤為重要。Gregg等[16]通過細(xì)菌酶組合化學(xué)合成的新型TLR4配體輔助化合物BECC438作為一種新型佐劑，BECC438引起平衡的IgG1/lgG2c應(yīng)答，在體外誘導(dǎo)細(xì)胞因子譜，誘導(dǎo)高抗菌素特異性免疫滴度和Th1相關(guān)的IgG2c免疫滴度，在動物模型中，使用BECC438作為佐劑的F1-V亞單位疫苗也成功保護(hù)了腹腔接種鼠疫桿菌的小鼠免于死亡。新型佐劑的研發(fā)可以有效解決亞單位疫苗免疫方式單一的問題，隨著各種佐劑的研發(fā)使用，亞單位疫苗在鼠疫免疫上有著很大潛力，目前亞單位疫苗主要研究對象是F1-V抗原，其他鼠疫抗原則少有研究，基于F1-V的二價(jià)或多價(jià)疫苗可能更有研究價(jià)值。

為降低LcrV的活性，北京市微生物與流行病學(xué)研究所通過在載體pET24a中插入rV270-凝血酶-六氧嘧啶融合基因，或在載體pET32a中插入六氧嘧啶-腸激酶-rV270或六氧嘧啶- Xa-rV270融合基因制備了一種重組LcrV的變種——rV270蛋白。他們將F1與rV270混合，加入鋁制凝膠作為佐劑，制備了F1 + rV270亞單位疫苗[17]。在一個長期的動物實(shí)驗(yàn)中，雌性BALB/c小鼠免疫后539 d依然可以檢測出F1和rV270抗體，該疫苗可以維持一個長時(shí)間的體液免疫[18]。盡管F1+rV270亞單位疫苗仍然在研發(fā)中，只要提高其免疫效果，驗(yàn)證安全性，接種這種亞單位疫苗就有可能成為未來人類免疫鼠疫的主要方式之一。

3 結(jié)合疫苗

結(jié)合疫苗通常由鼠疫桿菌保護(hù)性抗原與活載體結(jié)合得到，由于需要使用活載體，必須精確衰減載體毒性，過高的衰減會降低載體誘發(fā)免疫的能力，降低表達(dá)保護(hù)性抗原的水平，而過低的衰減則會導(dǎo)致人體產(chǎn)生并發(fā)癥。盡管研發(fā)難度較高，結(jié)合疫苗強(qiáng)大的免疫作用和易于大批量生產(chǎn)的特點(diǎn)使得結(jié)合疫苗一直是鼠疫疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)。

牛痘病毒是天花的疫苗，也是許多傳染病和癌癥的常用疫苗載體，人體單次接種牛痘病毒可以獲得數(shù)十年的T細(xì)胞免疫應(yīng)答[19]。Embry等[20]使用重組ACAM2000牛痘病毒構(gòu)建了可表達(dá)LcrV-TM蛋白的LcrV-TM病毒株，通過電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)LcrV-TM蛋白表達(dá)在成熟病毒粒子的表面，接受該疫苗免疫的小鼠在接種15倍半數(shù)致死量的鼠疫桿菌后，5 d存活率達(dá)100%，而僅接受LcrV蛋白免疫的小鼠存活率只有20%，由此推斷，牛痘病毒可有效提高傳遞抗原的效率，更好的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。

腺病毒載體是一種轉(zhuǎn)導(dǎo)效率極高的病毒載體，由于其轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)后不整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)，僅在細(xì)胞核內(nèi)染色之外進(jìn)行表達(dá)，所以擁有很高的安全性，被證明具有佐劑活性以及促進(jìn)細(xì)胞免疫的能力，在基因治療方面被廣泛應(yīng)用[21]。在2008年，Sofer-Podesta等[22]合成篩選并純化得到了腺病毒介導(dǎo)的產(chǎn)生LcrV抗原的疫苗AdαV，通過蛋白質(zhì)印跡法分析，接種疫苗小鼠血清中迅速出現(xiàn)LcrV抗原，發(fā)生免疫反應(yīng)。對暴露前6 h，暴露時(shí)和暴露后6 h的小鼠進(jìn)行免疫，小鼠平均存活率為93.7%，證明AdαV在暴露前后均有療效。2016年，Sha[23]等將融合基因YFV(包括ycsF、caf1和lcrV)導(dǎo)入一種復(fù)制缺陷的人5型腺病毒載體中，得到了rAd5-YFV三價(jià)疫苗，并在食蟹猴模型中提供了100%的保護(hù)，這種疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。腺病毒載體能否搭載更多鼠疫抗原還未被研究，更多高價(jià)疫苗可能對鼠疫桿菌，尤其是耐藥性鼠疫桿菌有更好的免疫效果。

4 DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗，是將外源基因直接注射到體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，從而引起細(xì)胞或體液免疫的疫苗。DNA疫苗單次接種后可持續(xù)較長時(shí)間，能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫，擁有較好的免疫效果，適合大批量生產(chǎn)，并且存儲以運(yùn)輸方式為干粉，適合商業(yè)化[24]。2010年，Yamanaka構(gòu)建了可表達(dá)F1-V 或V-Ag的淋巴細(xì)胞趨化因子(LTN)DNA疫苗LTN/F1-V和LTN/V-Ag，通過鼻腔給藥時(shí)，兩種DNA疫苗對小鼠保護(hù)作用不明顯；通過對TH細(xì)胞光譜的比對，發(fā)現(xiàn)鼻腔給藥影響了TH17細(xì)胞免疫效應(yīng)的產(chǎn)生，而肌內(nèi)注射DNA疫苗的療效則要明顯提高，肌內(nèi)注射也是DNA疫苗主要接種方式[25]。近年來，電穿孔技術(shù)逐漸使用在了DNA疫苗中，與傳統(tǒng)注射疫苗相比，使用電穿孔技術(shù)可使體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答增加100倍[26]。單獨(dú)表達(dá)LcrV的DNA疫苗后被證明可以引起CD8+T細(xì)胞對LcrV的特定表位的免疫應(yīng)答，LvrV上存在潛在的T細(xì)胞表位[27]。構(gòu)建可表達(dá)F1-V-Ag的疫苗或許是接下來LTN DNA疫苗的研究方向，由于是近年來新興的疫苗，DNA疫苗在人體上能否表達(dá)及是否安全也有待研究。

5 結(jié)語與展望

近年來防止生化武器威脅需求不斷擴(kuò)大，研制新型有效的鼠疫疫苗迫在眉睫。在如今形勢下，研制鼠疫炭疽等烈性傳染病的混合疫苗和多價(jià)疫苗將成為趨勢。滅活疫苗和減毒活疫苗可有效防治野生型鼠疫，但其不穩(wěn)定的安全性和無法防治耐藥型鼠疫成為無法忽視的弱點(diǎn)。亞單位疫苗和基于亞單位疫苗的結(jié)合疫苗是如今疫苗研制的熱點(diǎn)，高效且安全的免疫是其主要優(yōu)勢，而DNA疫苗目前依然難以離開實(shí)驗(yàn)室，研制對人體有效的DNA疫苗任重道遠(yuǎn)。