張志軒，崔樹婷，朱中博，彭超，吳紅彥

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518001

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，分離純化中藥有效部位或有效成分，除去其他無效、低效或有毒成分，降低服用劑量，告別中藥制劑的粗糙過程已是大勢所趨[1]。中藥有效部位是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是其安全有效和質(zhì)量控制的關(guān)鍵，對(duì)揭示中藥多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)及中藥復(fù)方配伍內(nèi)在規(guī)律具有重要意義，中藥有效部位的提取與篩選對(duì)中藥新藥研發(fā)及指導(dǎo)臨床應(yīng)用有重要影響[2]。本文對(duì)中藥有效部位研究現(xiàn)狀，中藥提取、純化、分離技術(shù)及有效部位追蹤篩選方法做一綜述。

1 提取技術(shù)

中藥化學(xué)成分十分復(fù)雜，單味中藥往往含生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、萜類、甾體、糖類等多種化合物，復(fù)方中多味藥物配伍發(fā)揮功效不是簡單的化學(xué)成分疊加，而且一味藥對(duì)不同疾病發(fā)揮功效的成分不同。因此，有效部位提取方法研究尤為重要，尋找有效且適宜的提取方法是辨識(shí)中藥活性部位的關(guān)鍵，也是明確中藥藥效活性成分的關(guān)鍵。

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是傳統(tǒng)的中藥提取方法。在中藥提取分離過程中，由于溶劑的滲透作用，溶劑不斷地進(jìn)入藥材組織細(xì)胞，直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，使中藥有效成分溶出。常用方法為水提取法、有機(jī)溶劑提取法、煎煮法、連續(xù)提取法。宋莉等[3]采用蒸餾水、70%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等不同極性溶劑對(duì)夏枯草活性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)夏枯草不同溶劑提取物均有抗氧化活性，其中有效部位主要集中在70%乙醇提取物，其總酚和黃酮含量最高，且夏枯草70%乙醇提取具有較高的DPPH·、·OH清除活性和脂質(zhì)體過氧化抑制活性，夏枯草蒸餾水提取物清除活性最佳。溶劑提取法受提取溶劑性質(zhì)及提取次數(shù)、溫度、壓力、時(shí)間等影響，且有提取周期長、消耗溶劑大、純度低等缺點(diǎn)。

1.2 超聲提取法

超聲提取技術(shù)是近年來提取中藥有效成分的新工藝之一，是利用超聲波輻射藥物溶液產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)等，瞬時(shí)破壞藥材細(xì)胞壁，增強(qiáng)溶劑滲透作用，進(jìn)而增加中藥活性成分在溶劑中的溶出，具有提取率高、節(jié)省藥材與溶劑、提取時(shí)間短等優(yōu)勢，適用于絕大多數(shù)有效成分的提取[4]。殷明陽等[5]研究發(fā)現(xiàn)，超聲提取法能提高提取率、縮短提取時(shí)間，適用于含多糖類成分較多的中藥復(fù)方。超聲提取法雖具有提取率高的特點(diǎn)，但與中藥有效成分狀態(tài)、極性、溶解性等密切相關(guān)，也受超聲頻率、功率、時(shí)間等參數(shù)影響，適宜的超聲參數(shù)與在線測量技術(shù)問題有待研究。

1.3 超臨界萃取法

超臨界萃取法是利用流體在超臨界狀態(tài)黏度接近氣體、密度接近液體、擴(kuò)散系數(shù)介于氣-液之間的特點(diǎn)，以流體作為溶劑，通過改變溫度或壓力調(diào)節(jié)溶質(zhì)的密度，改變?nèi)苜|(zhì)的溶解能力，將有效部位提取出來，對(duì)中藥不同成分的提取分離具有高選擇性。目前常用的流體多為CO2，具有較低的臨界度與臨界壓力、較高的溫度和壓力靈敏性，常用于中藥有效成分提取[6]。王小生等[7]通過CO2超臨界萃取法對(duì)艾葉進(jìn)行揮發(fā)油提取工藝篩選，發(fā)現(xiàn)艾葉有效部位提取條件為萃取壓力20 MPa、溫度30 ℃及分離壓力8 MPa、溫度55 ℃，該條件下艾葉揮發(fā)油平均提取率為1.443%、桉油精提取量為0.318 mg/g。雖然超臨界流體萃取具有很多優(yōu)勢，但對(duì)中藥提取同樣存在局限性，超臨界萃取裝置價(jià)格昂貴，耗能較多，單獨(dú)使用常不能滿足有效成分純度的要求，且受中藥極性、分子量影響較大[8]。

1.4 微波提取法

微波提取是利用微波熱效應(yīng)對(duì)藥材及有機(jī)溶劑進(jìn)行加熱，根據(jù)不同物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同、吸收微波能力的差異，進(jìn)行中藥有效成分的溶出，達(dá)到提取目的。其提取效率高，操作簡單便捷，廣泛用于中藥提取研究。微波提取經(jīng)清洗、粉碎、浸泡、微波、分離、濃縮、干燥、粉化后得到提取物[9]，常用于提取黃酮類、苷類、萜類、有機(jī)酸、生物堿等中藥有效部位。劉丹彤等[10]在提取暖心方（紅參、熟附子、薏苡仁、橘紅）時(shí)采用單因素實(shí)驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)，微波提取有效成分最佳條件為功率1200 W、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)1次。對(duì)比其他提取法，微波提取工藝能縮短提取時(shí)間，節(jié)省物料成本，且有利于中藥復(fù)方的提取。但微波提取只適用于對(duì)熱穩(wěn)定的有效成分，對(duì)于熱敏性物質(zhì)，微波加熱可導(dǎo)致其變性失活[11]。所以，在應(yīng)用微波提取時(shí)需要考慮溶劑類型、提取時(shí)間、提取溫度、含水量、微波功率等因素影響。

1.5 大孔樹脂吸附法

大孔吸附樹脂通過表面系數(shù)、表面電性、形成氫鍵，選擇性吸附中藥內(nèi)有機(jī)化合物，具有選擇性好、穩(wěn)定性高、干擾因素少、可循環(huán)重復(fù)利用等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于分離中藥中有效部位和有效成分[12]。陳雪楓等[13]采用D101型大孔吸附樹脂對(duì)九味羌活湯不同溶劑提取物進(jìn)行分離純化，以總化合物數(shù)量及固形物得率為純化指標(biāo)，分別考察上樣量、濃度、洗脫濃度等因素對(duì)分離純化效率的影響，結(jié)果表明，大孔樹脂吸附法分離、純化九味羌活湯有效部位合理、穩(wěn)定、可行。劉飛等[14]通過抗病毒實(shí)驗(yàn)，篩選佩蘭最佳提取方法發(fā)現(xiàn)，AB-8弱極性大孔吸附樹脂對(duì)佩蘭的分離純化效果最佳，其體積分?jǐn)?shù)25%乙醇洗脫部位的T1值可達(dá)127.001，是佩蘭抑制腸道EV-71病毒的最佳有效部位。但大孔樹脂的吸附作用具有選擇性，對(duì)水溶性成分的分離效果明顯，對(duì)糖類、色素的吸附作用較弱，在實(shí)際應(yīng)用中有局限性。

1.6 超濾膜分離法

超濾膜分離技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種高效、節(jié)能、無污染分離技術(shù)，過程簡單，不存在相的轉(zhuǎn)換，能最大限度保持成分穩(wěn)定，因此在現(xiàn)代中藥生產(chǎn)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[15]。劉力等[16]對(duì)白芍水提液有效部位進(jìn)行PVC超濾膜分離研究，通過不同孔徑的超濾膜過濾分離白芍水提液，取過濾前后的處理液用高效液相色譜法分析有效成分白芍總苷含量，結(jié)果顯示，大孔徑超濾膜超濾后濾液中白芍總苷含量明顯高于原液。

2 有效部位篩選

對(duì)于中藥活性的傳統(tǒng)鑒別手段，主要是形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和化學(xué)方法。但中藥有效部位既包含有效成分，又含有未闡明的活性成分[17]，而運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)手段既能確定中藥有效部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，又能明確中藥其他部位的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[18]。

2.1 基于體內(nèi)生理功能篩選中藥有效部位

有效部位是中藥中具有相似化學(xué)性質(zhì)的一大類化合物，而多個(gè)有效部位的集合就成為中藥藥效組分群。由于中藥的復(fù)雜性及現(xiàn)代研究手段的局限性，目前尚無法全面概括中藥的化學(xué)成分，而有效部位研究能在一定程度上明確中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。多指標(biāo)分析體內(nèi)代謝及生理功能也是追蹤篩選中藥有效部位的方法之一。龐漢青等[19]通過測定血瘀模型大鼠血液流變學(xué)、凝血功能等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)丹參不同有效部位均能改善血瘀大鼠血液流變學(xué)及凝血功能，以丹參總酚酸和丹參總酮聯(lián)合使用效果最優(yōu)。

2.2 基于成分敲出技術(shù)篩選中藥有效部位

中藥成分敲出（撤出）技術(shù)，即研究中如果去除某一部分或某一味藥后對(duì)藥效影響很大，表明該成分或藥味是發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分；反之，表明該成分或藥味可用其他類似藥物替代，或與其他組分不產(chǎn)生協(xié)同作用。黃偉強(qiáng)等[20]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證葛根抗腹瀉組分為葛根素、大豆苷、大豆苷元及3’-羥基葛根素，其有效組分抗腹瀉的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與葛根具有等效性，并且發(fā)現(xiàn)葛根、葛根有效組分及經(jīng)方均可有效抑制番瀉葉引起的小鼠腹瀉頻次，同時(shí)發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯組與去葛根芩連湯組療效無顯著差異，表明葛根活性成分與葛根在組方中具有相同作用。

2.3 基于譜-效關(guān)系篩選中藥有效部位

中藥譜-效研究過程是先通過合適的化學(xué)分析手段最大程度表征中藥的化學(xué)信息，將中藥指紋圖譜中化學(xué)信息與體內(nèi)外藥效結(jié)果結(jié)合起來，采用合適的數(shù)據(jù)處理技術(shù)將“譜”與“效”聯(lián)系起來，找出與藥效活性相關(guān)的有效部位或有效部位群，常用于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究[21]。周婷婷[22]通過建立磨盤草正丁醇部位指紋圖譜及抗炎效果觀察，發(fā)現(xiàn)磨盤草正丁醇部位對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及棉球肉芽腫慢性炎癥均有明顯抑制作用，指紋圖譜比較分析顯示，正丁醇部位有效成分除來自原藥材的原型成分，還來源于小鼠代謝產(chǎn)物與應(yīng)激刺激。劉小花等[23]將黃芪指紋圖譜與小鼠利尿藥效相關(guān)聯(lián)進(jìn)行比較，篩選出黃芪乙酸乙酯部位為有效部位，乙酸乙酯部位利尿作用是其所有化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，且該部位富含中等極性的黃酮類化合物，能顯著提高小鼠排尿量，其指紋圖譜與利尿作用有一定對(duì)應(yīng)關(guān)系。目前，表征化學(xué)成分指紋圖譜技術(shù)存在一定局限性，亟待發(fā)展多種先進(jìn)技術(shù)或多技術(shù)聯(lián)用，以期盡量全面表征；藥效指標(biāo)選擇應(yīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合；而用于關(guān)聯(lián)譜-效的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)依據(jù)數(shù)據(jù)類型合理選擇，必要時(shí)多種方法相互佐證，以保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 基于體外模型細(xì)胞膜親和色譜篩選中藥有效部位

生物色譜技術(shù)作為一種新型的技術(shù)用于中藥活性部位的篩選，主要包括分子生物色譜和細(xì)胞膜色譜，是通過藥物與大分子蛋白或細(xì)胞相互作用，達(dá)到分離、純化和篩選活性的目的。其中細(xì)胞膜色譜是近年來中藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，其依據(jù)提取物的成分與活性細(xì)胞是否具有特異親和能力而進(jìn)行藥效成分分離和鑒定，親和力高的成分即藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。侯曉芳等[24]利用細(xì)胞膜色譜法并結(jié)合離體藥理實(shí)驗(yàn)，對(duì)四物湯中進(jìn)行拆方分析，發(fā)現(xiàn)川芎醇提后醋酸乙酯萃取部位是川芎發(fā)揮藥效有效部位，在此基礎(chǔ)上建立了以川芎有效部位為基礎(chǔ)的高效毛細(xì)管色譜指紋圖譜分析方法和高效液相色譜指紋圖譜分析方法。體外細(xì)胞膜色譜法能快速有效地對(duì)中藥有效部位和活性成分進(jìn)行初步篩選，為中藥高通量篩選提供途徑；與分子生物色譜相比，更具有整體性，更能體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性。然而，在篩選過程中，活性成分可能與功能性受體及非功能性受體相結(jié)合，篩選出的活性成分不能很好代表中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，需進(jìn)一步研究。

2.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥有效部位

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為中藥研究熱點(diǎn)，其系統(tǒng)性和整體性為中藥活性成分篩選研究提供新思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”的基礎(chǔ)上，采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龇椒A(yù)測藥物發(fā)揮藥效的活性成分[25]，常用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫有 Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine（TCMIP）、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）、Traditional Chinese Medicine Database等。其中，TCMSP是Ru等[26]在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)框架基礎(chǔ)上，建立的中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)，將中藥活性部位、藥物靶點(diǎn)、相關(guān)疾病可視化，自動(dòng)建立中藥活性物質(zhì)、藥物靶點(diǎn)和目標(biāo)疾病的網(wǎng)絡(luò)分析，為闡明中藥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、發(fā)現(xiàn)中藥關(guān)鍵活性物質(zhì)提供了基礎(chǔ)，并得到廣泛運(yùn)用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)學(xué)科的語言，將復(fù)雜的生物系統(tǒng)相互作用抽象表達(dá)為網(wǎng)絡(luò)，如何構(gòu)建符合中藥多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜關(guān)系仍是研究難點(diǎn)。

2.6 基于功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選中藥有效部位

活性蛋白組學(xué)技術(shù)是研究復(fù)雜蛋白質(zhì)組中酶活性的技術(shù)，是使用基于活性的化學(xué)探針將特定酶的活性形式可視化，確定中藥活性成分在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。近年來，越來越多中藥活性小分子探針被合成。Dai等[27]通過對(duì)黃酮類化合物黃芩苷進(jìn)行定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，合成基于黃芩苷活性的探針，確定肉堿棕櫚轉(zhuǎn)移酶1是黃芩苷的關(guān)鍵靶點(diǎn)，而黃芩苷能顯著降低脂質(zhì)累積，有效改善因飲食誘導(dǎo)的肥胖及肝臟脂肪變性相關(guān)癥狀。

2.7 基于腸道菌群技術(shù)篩選中藥有效部位

近年來，腸道菌群逐漸成為中藥活性成分的研究熱點(diǎn)。中藥通過口服進(jìn)入消化道，一部分直接通過胃黏膜吸收入血，另一些生物利用度較低的部分未經(jīng)上消化道吸收，通過小腸到達(dá)大腸，與腸道菌群接觸并發(fā)生相互作用，中藥有效部位成分不僅能改變腸道菌群代謝，且被腸道菌群轉(zhuǎn)化或代謝[28]。Yue等[29]通過對(duì)模型小鼠糞便樣品中細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)不易吸收入血的異喹啉類生物堿小檗堿能參與腸道菌群支鏈氨基酸的合成與代謝，改善胰島素抵抗，并且能降低模型小鼠及糖尿病患者血清腸道菌群支鏈氨基酸水平。由于腸道內(nèi)活性成分是藥物被吸收代謝后進(jìn)入腸道，加之腸道內(nèi)容物復(fù)雜，因此，腸道菌群中活性物質(zhì)還需要藥效學(xué)驗(yàn)證，或聯(lián)合多組學(xué)分析推測代謝物的變化。

3 小結(jié)及展望

目前，中藥有效部位的復(fù)雜性限制其臨床應(yīng)用。主要體現(xiàn)在：①中藥是多種不同成分在不同時(shí)間段協(xié)同作用時(shí)發(fā)揮藥效，具有時(shí)-效性；②中藥炮制方法不同，其有效成分及功效不同，如生黃連、酒黃連、姜黃連和萸黃連，炮制方法不同，功效也有所不同；③中藥經(jīng)體內(nèi)代謝、腸道菌群代謝會(huì)產(chǎn)生新成分[30]；④具有多方向功效類集的中藥往往藥材本身所含活性成分含量較低，藥效呈量效性，但現(xiàn)代分析檢測技術(shù)無法全面檢測中藥有效部位，有些成分可能至今尚未發(fā)現(xiàn)，使其作用被忽視，缺乏合理的動(dòng)物模型用于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選[31]。中藥有效部位研究是中藥現(xiàn)代化開發(fā)的有效思路之一，近年來，隨著現(xiàn)代科技與計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，有效部位的提取分離、純化技術(shù)不斷完善，新技術(shù)、新設(shè)備層出不窮，但如何提高有效部位提取率及環(huán)保節(jié)能的提取制備法仍是今后研究的方向；其次，盡管中藥有效部位追蹤篩選技術(shù)在不斷提升，中藥有效部位在新檢測技術(shù)、多組學(xué)分析、多種生物學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)等方面也取得進(jìn)展，但認(rèn)識(shí)到中藥是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用于機(jī)體，單一檢測方法有一定局限性，運(yùn)用多學(xué)科聯(lián)合篩選方法更能體現(xiàn)中醫(yī)藥的全面觀、整體觀[31]，也是中藥有效部位研究的趨勢。