董 犇，吳學(xué)峰，郝天英，李 丹，曾 瑩，吳思亮，寇筱雪，黎梓城 ，陳 勝 ，3，林勤保 ，3，鐘懷寧 ，3*，鄭建國(guó) *

（1．廣州海關(guān)技術(shù)中心，國(guó)家食品接觸材料檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣東），廣東 廣州 510623；2．暨南大學(xué)包裝工程研究所，廣東普通高校產(chǎn)品包裝與物流重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海 519070；3．中國(guó)食品接觸材料可持續(xù)發(fā)展工作組，廣東 廣州 510070）

聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）具有良好的透氣性、光澤度、穩(wěn)定性和成型性等性能[1]，被廣泛應(yīng)用于食用油、礦泉水、碳酸飲料等多個(gè)食品包裝領(lǐng)域[2－3]。目前，PET瓶已居塑料食品包裝領(lǐng)域之首[4]。但是，PET具有極強(qiáng)的化學(xué)惰性，是一種生物不可降解的材料，容易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此，對(duì)PET食品包裝的回收利用成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外解決塑料垃圾，保護(hù)生態(tài)安全的重大舉措，具有巨大發(fā)展前景[5－7]。

食品包裝用回收PET（rPET）材料的化學(xué)物質(zhì)和污染物比原生PET材料更加復(fù)雜[6]。一方面由于有不同種類的化學(xué)物質(zhì)用于食品包裝用rPET材料的生產(chǎn)和處理，如生產(chǎn)環(huán)節(jié)使用的單體、樹(shù)脂、添加劑、聚合反應(yīng)助劑等，而在生產(chǎn)過(guò)程中，受工藝、溫度、時(shí)間、輻照等因素的影響，材料和制品中有可能遷移出很多化學(xué)物進(jìn)入食品[8]；另一方面，在PET產(chǎn)品的消費(fèi)和機(jī)械回收再生處理中，可能會(huì)引入一些外來(lái)污染物，如食物油脂、飲料殘留、家庭清潔劑和農(nóng)藥等，這些物質(zhì)可能殘留在rPET中，并最終遷移到食品中[9]；上述這些物質(zhì)包括雜質(zhì)、副反應(yīng)、分解和降解產(chǎn)物以及環(huán)境污染物等，國(guó)際統(tǒng)稱為非有意添加物（NIAS）[10]。而在非有意添加物中，不少物質(zhì)已被確認(rèn)為毒性明確或風(fēng)險(xiǎn)較高的高關(guān)注污染物，如芳香族伯胺、全氟多氟化合物、環(huán)內(nèi)酯、礦物油[11]等；當(dāng)含有上述物質(zhì)的rPET用于食品接觸材料時(shí)，可能會(huì)遷移到食品中，從而威脅消費(fèi)者的身體健康[12]。歐洲EC NO 282/2008和美國(guó)FDA21CFR174．5均規(guī)定了從源頭開(kāi)始，rPET必須滿足一系列安全指標(biāo)要求才可用于制造食品包裝[6,13]。但國(guó)內(nèi)對(duì)食品接觸用rPET材料的研究才剛剛起步，本課題組近期發(fā)表了對(duì)于食品接觸用rPET材料中的有意添加物（IAS）和NIAS等物質(zhì)遷移量的分析檢測(cè)及安全評(píng)估方面的研究[14]。在政府監(jiān)管層面，由于擔(dān)心rPET的污染物來(lái)源不明而可能導(dǎo)致食品安全風(fēng)險(xiǎn)，目前為止尚未允許rPET用于生產(chǎn)食品接觸材料；國(guó)內(nèi)關(guān)于rPET中IAS/NIAS分析標(biāo)準(zhǔn)或方法尚未見(jiàn)報(bào)道。規(guī)范分析技術(shù)的缺失導(dǎo)致難于開(kāi)展食品接觸用PET的系統(tǒng)性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和評(píng)估工作，因此，亟需開(kāi)展針對(duì)中國(guó)rPET材料中IAS/NIAS檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)研究。

對(duì)rPET中檢出的NIAS進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別非常困難。許多NIAS物質(zhì)，特別是非揮發(fā)性有機(jī)物均無(wú)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或未包含在任何可用的數(shù)據(jù)庫(kù)中，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確、高效地鑒定檢出物；而軟電離（提供母離子信息）和串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜（提供子結(jié)構(gòu)信息）的使用可為未知物的定性提供豐富的信息。超高效液相色譜?四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（UPLC－QTOF MS）兼具上述功能而被視為未知物分析的有力手段，已成功用于食品接觸材料中IAS或NIAS的檢測(cè)[12,15－17]。這也為開(kāi)展rPET中IAS/NIAS殘留物的分析提供了一種新的技術(shù)路徑和工具。本文使用UPLC－QTOF MS技術(shù)對(duì)食品接觸用rPET制品中的非揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行非靶向篩查和分析。研究結(jié)果表明，所建立的方法具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，在食品接觸用rPET中非揮發(fā)性污染物的非靶向篩查方面具有十分廣泛的應(yīng)用前景。研究結(jié)果可為食品接觸用rPET材料的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、標(biāo)準(zhǔn)制修訂和風(fēng)險(xiǎn)管理評(píng)估工作提供有益參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1290－6546高效液相色譜－串聯(lián)高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；ME204電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli－Q超純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）；AS 7240BT超聲波發(fā)生器（天津奧特賽恩斯公司）；FM200高速旋轉(zhuǎn)研磨儀（廣州市厚普儀器有限公司）。

鄰苯二甲酸丁芐酯－D4（BBP－D4）購(gòu)自Dr．Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自Fisher公司。六氟異丙醇（純度>99%，HFIP）購(gòu)自麥克林公司；測(cè)試所需的初步清洗后的瓶片和粒子等PET產(chǎn)品由供應(yīng)商提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

BBP－D4標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，再用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

1.3 樣品制備及前處理

取適量的原生PET顆粒于高速旋轉(zhuǎn)研磨儀中粉碎成粉末狀，用作前處理方法優(yōu)化的測(cè)試樣品。

均勻穩(wěn)定樣品的制備：取適量的rPET瓶片于高速旋轉(zhuǎn)研磨儀中粉碎，用作條件優(yōu)化和測(cè)試的樣品。

在潔凈的玻璃瓶中分別稱取0．2～1．0 g待測(cè)樣品，加入適量的HFIP溶解聚合物，待溶解完全后，加入甲醇并超聲1 h使聚合物完全沉淀。隨后，將混合物以9 000 r/min離心10 min，取上清液，用1 mL甲醇洗滌離心管壁和殘留的沉淀，將所得上清液合并。在溫和氮?dú)饬骰蛐D(zhuǎn)蒸發(fā)條件下將上清液吹至近干，并用1 mL甲醇復(fù)溶。將復(fù)溶后的溶液通過(guò)0．22μm濾頭過(guò)濾，得到待測(cè)樣品。每種樣品設(shè)置兩個(gè)平行，并分析全過(guò)程的空白樣品。

1.4 UPLC－QTOF MS儀器條件

對(duì)于不揮發(fā)性物質(zhì)采用UPLC－QTOF MS在數(shù)據(jù)依賴型采集（DDA）模式下測(cè)試，具體條件如下：流動(dòng)相：A相：0．1%甲酸水，B相：甲醇；洗脫梯度：0～1．5 min，5%B；1．5～25 min，5%～98%B；25～32 min，98%B；32～32．1 min，98%～5%B；32．1～35 min，5%B；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：3μL；流速：0．3 mL/min；掃描模式：全一級(jí)離子掃描與全二級(jí)離子掃描，電離模式為ESI+和ESI?；毛細(xì)管電壓正模式為4 000 V，負(fù)模式為3 500 V；鞘氣流速：11 L/min；掃描范圍：一級(jí)離子：50～1 100m/z；二級(jí)離子：20～800m/z；二級(jí)離子碰撞能量：10、20、40 eV。

對(duì)UPLC－QTOF MS的測(cè)試數(shù)據(jù)，未知化合物通過(guò)Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件進(jìn)行分析。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室自建食品接觸材料數(shù)據(jù)庫(kù)，使用非靶向篩選的方法根據(jù)軟件的“化合物發(fā)現(xiàn)”和“鑒別”功能篩選出候選分子式，并與未知化合物的測(cè)試譜圖信息進(jìn)行比較分析。

檢出物質(zhì)的定量通過(guò)半定量方法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品盡可能選擇與待定量化合物的物理化學(xué)性質(zhì)相近且不與待定量化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)。本文半定量測(cè)試選擇鄰苯二甲酸丁基芐酯（BBP－D4）和對(duì)苯二甲酸作為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

樣品前處理技術(shù)在復(fù)雜樣品的分析過(guò)程中起著非常重要的作用，合適的前處理方法可提高痕量目標(biāo)物在樣品中的濃度和消除樣品基質(zhì)對(duì)分析的干擾[18]。本文首先通過(guò)測(cè)試原生PET樣品的加標(biāo)回收率（50μL 10 mg/L的BBP－D4），對(duì)樣品的前處理方式進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 沉淀溶劑的選擇沉淀溶劑是影響前處理效率的重要因素之一，如產(chǎn)生沉淀過(guò)快，則容易包裹待測(cè)物質(zhì)；如產(chǎn)生沉淀較慢或不產(chǎn)生沉淀，則需要消耗大量的溶劑，既增加實(shí)驗(yàn)溶劑消耗，也降低了測(cè)試效率。實(shí)驗(yàn)考察了幾種常見(jiàn)溶劑（丙酮、甲醇、正己烷）對(duì)BBP－D4加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果如表1所示，當(dāng)用甲醇作沉淀溶劑時(shí)，加標(biāo)回收率最高。這是因?yàn)榧状紴槌恋砣軇r(shí)，沉淀是顆粒狀固體，更有利于待測(cè)物質(zhì)的檢出。其余兩種溶劑中正己烷產(chǎn)生沉淀的速度較慢，而丙酮產(chǎn)生的沉淀為片狀固體。增加或減少溶解溶劑HFIP的量，回收率均會(huì)降低，這可能是由于溶劑量較多時(shí)，延長(zhǎng)了氮吹時(shí)間，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)損失較多；而溶劑量較少時(shí)，再沉淀時(shí)易包裹標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，造成回收率較低。此外，本文也考察了文獻(xiàn)方法[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1，序號(hào)7和8），獲得加標(biāo)回收率為55．0%和64．0%。因此，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為沉淀溶劑，溶解溶劑HFIP的用量為10 mL。

表1 不同種類沉淀溶劑及其用量對(duì)BBP－D4回收率的影響Table 1 Effects of different types and amounts of precipitation solvents on recoveries of BBP－D4

2.1.2 溶劑去除方式的優(yōu)化兩組平行實(shí)驗(yàn)的溶劑分別采用45℃氮吹至近干和45℃水浴加熱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑至近干兩種方式處理后進(jìn)行測(cè)試，BBP－D4的加標(biāo)回收率分別為66%和46%。但由于旋蒸加熱和高真空條件下導(dǎo)致加標(biāo)物質(zhì)損失較多。因此，選擇45℃氮吹作為溶劑去除方式。

2.1.3 樣品量的優(yōu)化待測(cè)樣品的用量對(duì)非有意添加物的篩查和定性非常重要。樣品量過(guò)高時(shí)，可能會(huì)對(duì)靈敏度非常高的四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜造成污染；樣品量過(guò)低時(shí)，易造成物質(zhì)漏檢或定性不準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)考察了待測(cè)樣品的質(zhì)量分別為0．2、0．4、1．0 g時(shí)對(duì)檢出物質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，隨著樣品量的增加，檢出物質(zhì)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度增加不明顯。因此，實(shí)驗(yàn)選擇0．2 g作為測(cè)試樣品量。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 測(cè)試方法的優(yōu)化DDA法是高于設(shè)定豐度閾值的母離子才會(huì)被送到碰撞室中，經(jīng)高能碰撞產(chǎn)生二級(jí)質(zhì)譜。該方法的優(yōu)點(diǎn)是其的二級(jí)質(zhì)譜相對(duì)比較干凈，有利于未知物的準(zhǔn)確定性分析；在非數(shù)據(jù)依賴型采集（Data－independent acquisition，DIA）中，一級(jí)質(zhì)譜中所有離子均會(huì)進(jìn)入碰撞室，經(jīng)高能碰撞后產(chǎn)生二級(jí)質(zhì)譜，該方法的缺點(diǎn)是一級(jí)質(zhì)譜中所有離子同時(shí)產(chǎn)生碎片，導(dǎo)致二級(jí)質(zhì)譜復(fù)雜，很難找到母離子和碎片離子的對(duì)應(yīng)關(guān)系，不利于未知物的定性分析；MS模式是離子以全通過(guò)的模式通過(guò)四極桿得到待測(cè)物的一級(jí)質(zhì)譜圖。實(shí)驗(yàn)考察了3種方法對(duì)檢出物質(zhì)個(gè)數(shù)和峰面積的影響，結(jié)果表明DDA法檢出物質(zhì)的個(gè)數(shù)和峰面積之和最優(yōu)，這主要是由于用于定性的質(zhì)譜譜庫(kù)均通過(guò)DDA法建立。因此，本文選擇DDA法作為測(cè)試方法。

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化UPLC－QTOF MS法常用的流動(dòng)相是0．1%甲酸水－乙腈或0．1%甲酸水－甲醇體系[19－20]。對(duì)未知物的篩查需要同時(shí)進(jìn)行正、負(fù)離子模式的電離，而已有文獻(xiàn)對(duì)于非有意添加物的篩查大多以0．1%甲酸水體系為主[14,19]，因此，本方法水相選擇0．1%甲酸水。而對(duì)于有機(jī)相，實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇和乙腈進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示使用甲醇為有機(jī)相時(shí)檢出物質(zhì)數(shù)量和峰面積最佳。綜上，本方法最終選擇0．1%甲酸水－甲醇體系作為最佳流動(dòng)相。

2.2.3 洗脫梯度的優(yōu)化合理的洗脫梯度可縮短分離時(shí)間，提高分離效果。在選擇洗脫梯度時(shí)，從水相到有機(jī)相的轉(zhuǎn)換速度需合適才能達(dá)到較好的分離效果。實(shí)驗(yàn)考察了測(cè)試時(shí)間分別為3、50 min時(shí)，5種洗脫梯度對(duì)檢出物數(shù)量和峰面積的影響。結(jié)果顯示，按“1．4”洗脫梯度時(shí)檢出物質(zhì)最多。因此，本方法選擇上述梯度進(jìn)行測(cè)試。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

采用樣品加標(biāo)方式來(lái)考察方法的精密度和準(zhǔn)確度。分別在經(jīng)相同處理過(guò)程的不同空白樣品中添加3個(gè)不同質(zhì)量濃度（0．05、0．5、5 mg/L）的BBP－D4。每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次。結(jié)果表明，BBP－D4的回收率為66．0%～80．4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1．3%～5．1%（見(jiàn)表2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足篩查需求。

2.4 定性分析

在優(yōu)化條件下，通過(guò)UPLC－QTOF MS分析了溶解沉淀處理后的rPET樣品中潛在未知物的殘留量。共鑒別出含3個(gè)有意添加物和27個(gè)非有意添加物在內(nèi)的30種化合物（見(jiàn)表3）。圖1顯示了rPET樣品中潛在未知物的總離子流色譜圖。3個(gè)有意添加物中，1，2-環(huán)己烷二羧酸二異壬基酯和鄰苯二甲酸二甲酯[21]是塑料中常用的增塑劑[22]，對(duì)苯二甲酸是生產(chǎn)PET的主要原料[1]。27個(gè)非有意添加物中，季戊四醇三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯廣泛應(yīng)用在涂料、油墨、粘合劑、光聚合物反應(yīng)等領(lǐng)域[23]，可能是回收過(guò)程中引入的污染物；棕櫚酸乙酯廣泛用作香料香精、軟化劑、潤(rùn)滑劑[24]，但未見(jiàn)報(bào)道在PET生產(chǎn)制備過(guò)程中使用；實(shí)驗(yàn)檢出環(huán)狀寡聚物10個(gè)、線性寡聚物15個(gè)，含量范圍為0．038～4．92 mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明檢出的寡聚物種類比較多，部分寡聚物的含量也相對(duì)較高，可能是由于從粒料到瓶子需要經(jīng)過(guò)大約300℃的高溫注塑處理，在此高溫過(guò)程中聚合物可能發(fā)生降解所致。此外，研究表明原生PET中也有寡聚物檢出[19－20,25]，經(jīng)過(guò)回收再生處理后寡聚物的量和種類是否有明顯的增加尚需進(jìn)一步研究。

表3 rPET樣品中鑒定出的化合物Table 3 Identification of screening compounds in rPET samples

（續(xù)表3）

圖1 樣品篩查物質(zhì)的TIC圖Fig．1 TIC chromatograms of screening compounds

2.5 樣品主成分分析（PCA）

PCA作為一種無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法，主要是通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理和從整體上直觀顯示各組樣品的差異。為區(qū)分不同來(lái)源rPET瓶片檢出物質(zhì)的差異，采集不同廠家的rPET瓶片（C組和N組），測(cè)試數(shù)據(jù)通過(guò)安捷倫Profinder 10軟件進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果導(dǎo)入SIMCA14．1軟件，選用PCA－X模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，正離子模式下rPET瓶片的C組和N組沿t[1]軸出現(xiàn)了明顯分化，表明檢出物質(zhì)差異較大（圖2）；而負(fù)離子模式下部分樣品差異較小。以上結(jié)果表明該方法在正離子模式下的檢出物可區(qū)分不同來(lái)源的rPET瓶片。為進(jìn)一步找出有重要貢獻(xiàn)的顯著性差異成分，根據(jù)變量投影重要性（VIP）>1．2與S－plots圖中p（corr）>0．60的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異化合物，通過(guò)文獻(xiàn)檢索、數(shù)據(jù)庫(kù)匹配及裂解規(guī)律，共鑒定出15個(gè)顯著性差異成分（如表4）。其中介酸酰胺常作為各種塑料、樹(shù)脂的抗粘劑和滑爽劑[26]；1，3：2，4-二（3，4-二甲基亞芐基）-D-山梨醇作為成核劑廣泛應(yīng)用于各種常見(jiàn)塑料中[27]；磷酸三辛酯作為增塑劑廣泛使用于PET等各種塑料加工過(guò)程中[28]；其余線型和環(huán)狀寡聚物12個(gè)。根據(jù)以上結(jié)果，推測(cè)不同地域廠家生產(chǎn)的rPET瓶片中寡聚物等物質(zhì)含量隨著所處環(huán)境不同而有顯著差異。

圖2 不同樣品在PCA－X模式下的Scores圖Fig．2 Scores diagrams of different samples under PCA－X mode

表4 篩選出顯著性差異成分列表Table 4 List of significant of difference ingredients

3 結(jié) 論

本研究建立了一種UPLC－QTOF MS測(cè)定rPET瓶片中非揮發(fā)性物質(zhì)的非靶向篩查方法，優(yōu)化了不同沉淀溶劑、溶劑去除方式、樣品量等前處理?xiàng)l件和流動(dòng)相、洗脫梯度以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方法等測(cè)試條件，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析了檢出物化學(xué)成分的變化，區(qū)分了不同來(lái)源的兩組rPET瓶片中檢出物質(zhì)的差異。方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、分離能力強(qiáng)，可用于rPET瓶片中非有意添加物的非靶向篩查的相關(guān)研究，也可為政府和行業(yè)開(kāi)展食品接觸用rPET的再生利用以及安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。