楊 磊 胡偉華 俞燕潔 陳睿毅 徐冬冬①

白消安及其與高溫聯(lián)合處理對黃姑魚()性腺發(fā)育的影響*

楊 磊1, 2, 3胡偉華2, 3俞燕潔1, 2, 3陳睿毅2, 3徐冬冬2, 3①

(1. 浙江海洋大學水產(chǎn)學院 舟山 316022; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316021; 3. 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室 舟山 316021)

黃姑魚()的性成熟周期短, 養(yǎng)殖技術成熟, 是合適的生殖細胞移植受體。不育受體的制備在魚類生殖細胞移植中非常關鍵。為了優(yōu)化不育黃姑魚的制備方法, 采用白消安和白消安-高溫(30 °C)對黃姑魚進行處理, 設置5個組: 對照組(Con組)、白消安10 mg/kg組(Bu10組)、白消安40 mg/kg組(Bu40組)、白消安10 mg/kg高溫組(Bu10H組)、白消安40 mg/kg高溫組(Bu40H組), 白消安以不同劑量進行2次的腹腔注射, 間隔兩周。采用組織學、qPCR以及原位雜交等方法分析白消安及其與高溫聯(lián)合處理對黃姑魚性腺及其生殖細胞和體細胞發(fā)育的影響。研究結果表明白消安處理對黃姑魚生殖細胞的影響具有明顯的性別差異: 雄魚在處理28 d后其性腺重和GSI較對照組顯著下降, 進一步組織學觀察發(fā)現(xiàn)雄魚精巢在處理14 d時已經(jīng)出現(xiàn)空腔, qPCR分析發(fā)現(xiàn)雄魚基因表達在處理期間顯著降低, 且在處理第48 d仍處于下調(diào)狀態(tài)。然而, 白消安及其與高溫聯(lián)合處理并未對雌魚生殖細胞產(chǎn)生明顯的影響。研究還發(fā)現(xiàn)高溫處理組出現(xiàn)較高的死亡率, 但雄魚生殖細胞的消除效果并未顯著增強。因此, 白消安處理能夠消除黃姑魚雄魚性腺內(nèi)的生殖細胞, 以40 mg/kg白消安2次(間隔兩周)注射后消除效果最好, 能夠作為生殖細胞移植受體魚。

黃姑魚(); 白消安; 生殖細胞移植;; 原位雜交

魚類生殖細胞移植是將供體(donor)的生殖細胞移植到同種或異種受體(recipient)中, 利用受體生產(chǎn)供體的配子, 繁育供體的后代, 也被形象地稱為“借腹生子”或代孕親魚(surrogate broodstock)技術, 該技術在縮短魚類的性成熟周期、性控育種、瀕危物種保護和基因資源保存等方面具有巨大的應用前景(Yoshizaki,2018)。因此, 魚類生殖細胞移植研究受到學者的高度重視。一般而言, 生殖細胞移植主要包括: (1) 供體細胞的制備, (2) 受體的選擇與制備, (3) 供體細胞注射到受體體內(nèi)培育至性成熟。經(jīng)過十多年的發(fā)展, 魚類生殖細胞移植取得了一系列的進展: (1) 先后利用胚胎、仔魚和成魚作為受體, 建立了生殖細胞移植技術(Ciruna,2002; Takeuchi,2003,2004; Okutsu,2006); (2) 發(fā)現(xiàn)了魚類性腺的精原或卵原干細胞, 從而拓寬了供體移植細胞的來源(Takeuchi,2003); (3) 研發(fā)了多種方法制備受體, 其制備方法逐步完善。目前在多種海淡水魚類中開展了生殖細胞移植的研究, 但成熟的移植體系報道較少, 究其原因, 主要受限于移植受體的制備。

在生殖細胞移植中, 由于受體自身的生殖細胞與供體的生殖細胞存在著競爭關系, 制備不育受體成為生殖細胞移植的關鍵。目前, 研究學者通過三倍體誘導(Yoshikawa,2017)、人工雜交(Xu, 2019; Kawamura, 2020)、高溫-化學藥物處理(de Siqueira-Silva,2015; Majhi,2017)以及基因敲除或敲降(Yoshizaki,2016; Yoshikawa, 2020)等方法制備不育受體。其中, 以白消安或白消安和高溫聯(lián)合處理的方法, 能夠使魚類的生殖細胞凋亡。該方法簡便易行, 是制備不育受體的可行性途徑。在羅非魚()、銀漢魚()、斑馬魚()等魚類中, 已經(jīng)證實白消安或白消安-高溫處理的方法能夠消除其生殖細胞, 制備生殖細胞移植的不育受體(Majhi,2009a; Lacerda,2010; Nóbrega,2010)。雖然白消安處理可以使生殖細胞凋亡, 但不同種類的處理濃度、方式及時間區(qū)別很大, 誘導效果也有較大差異(de Siqueira-Silva,2015)。因此, 對于不同的魚種, 有必要通過優(yōu)化處理時間、溫度和白消安的劑量等, 研制高溫-聯(lián)合化學藥物的處理方法制備生殖細胞移植的受體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本試驗于2019年10—11月在浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗基地(西軒漁業(yè)科技島, 舟山)實施。實驗魚選取150日齡(dph, day post hatching)黃姑魚[全長: (16.13±0.95) cm; 體重: (45.77±8.79) g], 在實驗開始前先逐步升溫使各桶到達預定溫度。

1.2 實驗方法

將實驗魚隨機挑選到10個玻璃缸桶中(500 L,=50尾/桶), 分成5組, 每組兩個平行: 對照組(Con組), 白消安處理組1 (注射濃度: 10 mg/kg, Bu10組), 白消安-高溫處理組1 (注射濃度: 10 mg/kg; 處理溫度: 30 °C, Bu10H組), 白消安處理組2 (注射濃度: 40 mg/kg, Bu40組), 白消安-高溫處理組2 (注射濃度: 40 mg/kg; 處理溫度: 30 °C, Bu40H組)。溫度處理組用溫控儀控制水溫, 實驗開始前以2 °C/d的幅度升溫至30 °C并穩(wěn)定一周, 實驗期間每日上午和下午投喂商品飼料各一次, 吸底換水一次, 記錄每日死亡數(shù)并將死魚撈出。

實驗開始前測量實驗魚的全長、體長和體重。在實驗開始第1天、第14天分別按照劑量腹腔注射白消安, 對照組注射生理鹽水, 在第1天、第14天、第28天、第38天和第48天測量生長參數(shù)并稱量性腺重量, 取樣采用4%多聚甲醛（PFA）固定用于組織切片和原位雜交, RNA樣品保存于RNA保護液于4 °C過夜后置于–80 °C冰箱保存。

1.3 組織切片學觀察

性腺組織取樣后以PFA固定, 24 h后逐步更換30%、50%、75%、90%、100%的甲醇, 最終浸泡在100%甲醇中置于–20 °C冰箱保存?zhèn)溆?。將樣品取出?jīng)透明浸蠟后包埋于石蠟中, 以5 μm厚度切片, 用蘇木精-伊紅染色, 最后用光學顯微鏡觀察, 拍照。

1.4 基因表達分析

性腺組織按照總RNA提取試劑盒(Solarbio, 總RNA提取試劑盒)操作方法提取總RNA, 用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA, 以為內(nèi)參基因, 基因序列如表1所示, 按照TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒說明書要求進行熒光定量PCR實驗。最后用Spss19.0軟件分析各基因表達差異性。

表1 用于熒光定量PCR分析的基因及其引物序列

Tab.1 Genes for qRT-PCR and their primer sequences

1.5 原位雜交

將固定在PFA中的樣品取出, 經(jīng)透明、浸蠟后包埋于石蠟中。隨后以二甲苯脫蠟, 用梯度酒精水化后依次添加PBST、蛋白酶K、TEA、PBST、PFA、PBST, 再用HYB雜交液預雜交, 隨后在HYB雜交液中加入探針(探針序列如表2所示), 60 °C雜交過夜。雜交過夜后用梯度SSC洗脫探針, blocking buffer室溫封閉后加入抗體Fab-AP孵育過夜。孵育過夜后用MABT、PBST、AP buffer洗脫并用NBT/BCIP避光顯色, 顯色后用PBST終止反應, PFA固定后中性紅復染。復染后用梯度酒精和二甲苯洗脫染料并封片觀察。

表2 用于原位雜交的基因及其探針序列

1.6 數(shù)據(jù)分析

性腺成熟指數(shù)GSI按照公式GSI=(性腺重)/(體重)í100%計算, 并進行反正弦平方根轉換后比較; 用單因素方差分析及多重比較分析各組體重、性腺重的差異性(<0.05)。

2 結果

2.1 生長指標和性腺成熟指數(shù)GSI

實驗期間, 各處理組(Bu10組, Bu40組及Bu40H組)雄魚的體重較對照組相比無顯著性差異(>0.05, 圖1a), 而處理組(Bu40組及Bu40H組)雄魚的性腺重和GSI在處理第28天時較對照組顯著下降(<0.05), Bu10組雄魚的性腺重和GSI也低于對照組, 但差異不顯著(>0.05, 圖1b, 1c); 在處理第18天、第38天、第48天時處理組(Bu10組, Bu40組及Bu40H組)雄魚的性腺重和GSI與對照組相比無顯著性差異(>0.05, 圖1b, 1c)。各處理組(Bu10組, Bu40組及Bu40H組)雌魚的體重、性腺重和GSI與對照組相比沒有顯著性差異(>0.05, 圖1d, 1e, 1f)。Con組、Bu10組、Bu40組在實驗期間無死亡現(xiàn)象, 而白消安-高溫處理組Bu10H組和Bu40H組出現(xiàn)不同程度死亡, 存活率分別為11.4%±0.3%、41.8%±13.0% (圖2)。

2.2 組織學觀察

組織學觀察發(fā)現(xiàn)處理組(Bu10組, Bu40組及Bu40H組)雄魚性腺內(nèi)的生殖細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡(圖3)。在處理第14天、第28天時, 對照組雄魚的精巢內(nèi)充滿精子(圖3a, 3e); 相比之下, Bu10組、Bu40和Bu40H組雄魚的精小葉內(nèi)均出現(xiàn)空腔(圖3b, 3f)。Bu40和Bu40H組雄魚的精小葉內(nèi)的空腔面積較大, 只剩下少量精原細胞(圖3c, 3d, 3g, 3h)。

不同的是, 處理組雌魚在白消安及其與高溫聯(lián)合處理后并未發(fā)生生殖細胞凋亡現(xiàn)象(圖4)。在處理第14天、第28天時, 對照組雌魚卵巢內(nèi)存在大量卵母細胞(圖4a, 4e); 而Bu10組、Bu40組及Bu40H組雌魚卵巢內(nèi)同樣存在大量卵母細胞, 卵母細胞完整, 并未出現(xiàn)空腔(圖4)。

2.3 基因表達

熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)白消安及其與高溫聯(lián)合處理后, 處理組雄魚精巢內(nèi)基因表達量下降, 而雌魚卵巢內(nèi)基因表達量未受影響(圖5a, 5c)。Bu40組及Bu40H組雄魚精巢內(nèi)基因表達量在處理第14天時與對照組相比顯著下降(<0.05, 圖5a), 并在處理第28天、第38天、第48天仍處于顯著下降狀態(tài)(<0.05, 圖5a); Bu10組雄魚精巢內(nèi)基因表達量在處理第14天時與對照組相比顯著上升(<0.05, 圖5a), 但在處理第28天時顯著下降, 且處理第38天、第48天仍處于顯著下降狀態(tài)(<0.05, 圖5a)。不同的是, 處理第14天至第48天間, 處理組(Bu10組, Bu40組及Bu40H組)雌魚卵巢內(nèi)基因表達未出現(xiàn)顯著下降現(xiàn)象(圖5c)。

處理后雄魚精巢內(nèi)基因及雌魚卵巢內(nèi)基因的表達量并未下降(圖5b, 5d)。在處理第14天時, 處理組(Bu10組, Bu40組及Bu40H組)雄魚精巢內(nèi)基因表達量與對照組相比均顯著上升(<0.05, 圖5b);在處理28天時, Bu10組及Bu40H組雄魚精巢內(nèi)基因表達量與對照組相比無顯著差異(>0.05, 圖5b); 除Bu10組雄魚精巢內(nèi)基因表達量在處理第38天有顯著下降外(<0.05, 圖5b),其余處理組(Bu40組及Bu40H組)在處理第38天、第48天精巢內(nèi)基因表達量均未顯著下降(圖5b)。處理第14天時各處理組(Bu10組, Bu40組及Bu40H組)雌魚卵巢內(nèi)基因表達量與對照組相比無顯著差異(>0.05, 圖5d); Bu10組及Bu40組雌魚在處理第28天基因表達量顯著下降(<0.05, 圖5d), 但在處理第38天恢復正常; 在處理第48天時Bu40組基因表達量有顯著下降(<0.05, 圖5d)。

圖1 白消安及其與高溫聯(lián)合處理對黃姑魚生長、性腺重及GSI的影響

注: a. 雄魚體重; b. 雄魚性腺重; c. 雄魚GSI; d. 雌魚體重; e. 雌魚性腺重; f. 雌魚GSI

圖2 不同處理組黃姑魚的存活率比較

2.4 原位雜交

對處理14天時各組雌雄魚性腺內(nèi)的基因進行原位雜交分析, 結果發(fā)現(xiàn)對照組雄魚性腺內(nèi)有強烈的基因陽性信號(圖6a), 對照H.E染色圖可知, 信號主要集中于生殖細胞(精母細胞)所在區(qū)域(圖6c); 而Bu40組雄魚性腺內(nèi)的基因陽性信號較弱(圖6d), 組織切片發(fā)現(xiàn)此時精巢內(nèi)基本沒有生殖細胞(圖6f)。在雌魚中, 對照組雌魚性腺內(nèi)有強烈的基因陽性信號(圖7a), 組織切片發(fā)現(xiàn)信號主要集中于卵母細胞的胞質(zhì)內(nèi)(圖7c); 而Bu40組雌魚性腺內(nèi)也存在強烈的基因陽性信號(圖7d), 集中于卵母細胞的胞質(zhì)內(nèi)(圖7f)。因此, 白消安處理后雄魚基因表達顯著下降, 而雌魚未受影響。

圖3 不同處理組雄魚性腺的組織學觀察

注: a—d為各組第14天時的精巢, e—f為各組第28天的精巢; a & e. Con組; b & f. Bu10組; c & g. Bu40組; d & h. Bu40H組; 比例尺為20 μm

圖4 不同處理組雌魚性腺組織學觀察

注: a—d為各組第14天時的卵巢, e—f為各組第28天的卵巢; a & e. Con組; b & f. Bu10組; c & g. Bu40組; d & h. Bu40H組; 比例尺為20 μm

圖5 白消安及其與高溫聯(lián)合處理對黃姑魚的vasa、dmrt1和cyp19a基因表達的影響

注: a. 雄魚基因表達量; b. 雄魚基因表達量; c. 雌魚基因表達量; d. 雌魚基因表達量

圖6 處理14 d時不同處理組雄魚性腺vasa基因原位雜交圖

注: a—c為對照組第14天時的精巢, d—f為Bu40組第14天的精巢; a & d.基因T7探針原位雜交圖; b & e.基因SP6探針原位雜交圖; c & f. 性腺組織學切片圖; 其中T7為反義探針, SP6為正義探針。原位雜交圖中深色區(qū)域為陽性信號區(qū)域; 比例尺為20 μm

圖7 處理14 d時不同處理組雌魚性腺vasa基因原位雜交圖

注: a—c為對照組第14天時的卵巢, d—f為Bu40組第14天的卵巢; a & d.基因T7探針原位雜交圖; b & e.基因SP6探針原位雜交圖; c & f. 性腺組織學切片圖; 其中T7為反義探針, SP6為正義探針。原位雜交圖中深色區(qū)域為陽性信號區(qū)域; 比例尺為20 μm

3 討論

在魚類生殖細胞移植中, 清除受體的內(nèi)源性生殖細胞, 會顯著提高移植效率(Nóbrega, 2009; Majhi, 2014)。在淡水和模式魚類中, 已有研究證明白消安和高溫處理會導致生殖細胞凋亡(Lacerda, 2006, 2010; Majhi, 2009a, b; Nóbrega, 2010), 然而針對海水魚類的相關研究較少。本研究采用白消安和高溫聯(lián)合處理黃姑魚, 我們觀察到注射白消安后第14天各組的雄魚性腺內(nèi)均出現(xiàn)空腔, 其中Bu40組效果最佳, 基本消除了精子和精母細胞; 相比于白消安處理組, 高溫-白消安聯(lián)合處理組的效果并沒有顯著增強, 且出現(xiàn)較高的死亡率, 因此關于溫度對黃姑魚生殖細胞的影響還需要進一步研究。

本研究中, 白消安和溫度處理僅對消除雄魚生殖細胞有效, 對于雌魚生殖細胞的消除并不理想, 因此白消安對雌雄黃姑魚的影響表現(xiàn)出明顯的性別差異。在鯉()中發(fā)現(xiàn)白消安處理后其雌雄魚的生殖細胞均受到影響(Majhi, 2017), 而銀漢魚則是對雄魚的消除效果要強于雌魚(Majhi, 2009a), 這說明白消安對魚類生殖細胞的影響可能因魚種而異。高溫對魚類生殖細胞的影響也是值得注意的, 已有研究表明單獨的高溫處理(25 °C)也能消除銀漢魚的生殖細胞(Majhi, 2009a)。在羅非魚中還發(fā)現(xiàn)較低的溫度(20 °C)更易使雄魚生殖細胞凋亡(de Alvarenga, 2009), 表明高溫并不一定促進魚類生殖細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)白消安-高溫處理組與白消安處理組對生殖細胞的影響無明顯差異, 并未表現(xiàn)出聯(lián)合處理的累加效果。但是, 由于本研究僅設置了一個溫度處理, 還需要進一步的試驗來明確溫度對黃姑魚生殖細胞的影響。

性腺成熟指數(shù)GSI能反映魚類性腺的飽滿程度。在處理期間, 雄魚的GSI有顯著下降, 隨后恢復正常, 雌魚GSI并無明顯變化, 這與組織學觀察結果基本一致。基因是生殖細胞的標記基因, 主要在魚類的生殖細胞中表達(Boonanuntanasarn, 2016; Duangkaew, 2019)。本研究通過熒光定量PCR對黃姑魚性腺基因進行定量分析, 結果發(fā)現(xiàn)實驗期間Bu10組、Bu40組、Bu40H組的雄魚性腺內(nèi)基因表達較對照組均有顯著下降且在處理結束后較長一段時間內(nèi)仍處于下調(diào)狀態(tài), 而雌魚性腺內(nèi)基因表達則無顯著變化; 同樣,基因的原位雜交結果也表明基因在處理組的雄魚精巢內(nèi)表達顯著下降, 而在雌魚卵巢內(nèi)的表達并沒有顯著影響。在鯉魚(Majhi, 2017)、銀漢魚(Majhi, 2009a)等魚類上也發(fā)現(xiàn)白消安處理后實驗魚性腺內(nèi)的基因表達被抑制, 甚至在結束處理10周后仍被抑制。和分別是雌雄魚的體細胞標記基因, 這兩個基因的表達分析發(fā)現(xiàn)白消安和白消安-高溫處理并沒有顯著影響其表達, 表明上述處理可能對性腺體細胞沒有顯著影響。

在高溫和白消安的處理過程中, 魚體受到的損傷也是非常值得關注。白消安具有毒性, 其安全劑量因物種而異, 過量的劑量可能會引起實驗對象的死亡(Ogawa, 1999)。對小鼠的研究表明若是劑量過大會使小鼠中毒, 導致白消安無法有效清除其體內(nèi)的生殖細胞(Brinster, 2003)。在魚類中, 白消安的毒性存在性別差異性: 當以40 mg/kg劑量處理1齡銀漢魚時, 雌雄魚內(nèi)源性生殖細胞均凋亡, 雄魚能正常存活而雌魚皮膚出現(xiàn)潰瘍并有較高的死亡率(Majhi, 2009a)。本研究中, 單獨注射白消安并未造成黃姑魚死亡, 因此推測實驗的注射劑量是適宜的。但是, 高溫-白消安聯(lián)合處理組出現(xiàn)較高的死亡率, 這可能是由于二者聯(lián)合作用導致魚體機能受到影響, 容易造成病菌感染而引發(fā)死亡。

4 結論

綜上, 白消安處理能夠消除黃姑魚雄魚精巢內(nèi)的生殖細胞, 但對雌魚生殖細胞的消除效果并不明顯; 而且, 白消安處理并不會影響其體細胞。在實際應用中, 由于高溫處理容易造成較高的死亡率, 因而不宜使用。通過上述實驗的優(yōu)化, 本研究認為采用40 mg/kg濃度兩次間隔注射白消安能夠制備不育黃姑魚。

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EFFECTS OF BUSULFAN AND ITS COMBINED TREATMENT WITH HIGH TEMPERATURE ON GONADAL DEVELOPMENT OF YELLOW DRUM ()

YANG Lei1, 2, 3, HU Wei-Hua2, 3, YU Yan-Jie1, 2, 3, CHEN Rui-Yi2, 3, XU Dong-Dong2, 3

(1. College of Fisheries, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan 316021, China; 3. Key Laboratory of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China)

Yellow drum () is a suitable recipient for germ cell transplantation due to its short sexual maturation and fully-developed aquaculture technology. Sterile recipient fish is critical for the success of germ cell transplantation. To optimize the preparation method of sterile yellow drum, we use treatments of busulfan-only and busulfan-high-temperature to the yellow drums.Five groups were set up: the control (Con), groups with 10 mg/kg busulfan injection (Bu10), 40 mg/kg busulfan injection (Bu40), 10 mg/kg busulfan injection in high temperature (30 °C) (Bu10H), and 40 mg/kg busulfan injection in high temperature (30 °C) (Bu40H). Busulfan was injected intraperitoneally twice on Day 1 and Day 14, respectively, in above-mentioned experimental dosages. The histology, qPCR, andhybridization were used to analyze the effects of busulfan and the high-temperature combination treatment on the development of gonads, germ cells, and somatic cells. Results show significant gender difference in the effect of busulfan treatment on the germ cells of yellow drum. On Day 28 post treatment, the gonad weight and GSI of male yellow drum decreased significantly compared with those of the control group. Histological observation revealed that cavities in the testis of male individuals were observed on Day 14 post treatment. The qPCR analysis showed that theexpression in males was significantly decreased during treatment and remained down-regulated on Day 48 post treatment. However, busulfan-only and busulfan-high-temperature combination treatment had insignificant effect on the germ cells of females. However, the high temperature treatment resulted in high mortalities while the elimination of male germ cells was not significantly enhanced. Therefore, the germ cells in the male gonad could be eliminated by busulfan treatment, and the best treatment was busulfan injection at 40 mg/kg in an interval of about two weeks, which is suitable for the preparation of recipient fish for germ cell transplantation.

yellow drum (); busulfan; germline cell transplantation;;hybridization

* 國家自然科學基金項目, 31972785號; 浙江省杰出青年基金項目, LR21C190001號; 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題, 2020KF013號。楊 磊, 碩士研究生, E-mail: yanglei-1996@qq.com

徐冬冬, 研究員, E-mail: xudong0580@163.com

2021-04-25,

2021-07-13

Q955; Q789; S965.325

10.11693/hyhz20210400104