李玲玲 謝超伊 宋宏策 陳 熙 劉文娟 黃寶玉 張美溦 劉雅瓊 魏 磊 王曉通

長(zhǎng)牡蠣()黑色殼表面微生物多樣性的研究*

李玲玲 謝超伊 宋宏策 陳 熙 劉文娟 黃寶玉 張美溦 劉雅瓊 魏 磊①王曉通①

(魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院 煙臺(tái) 264025)

為探究自然海區(qū)與室內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)軟體動(dòng)物殼色及殼表面細(xì)菌群落多樣性的影響, 以黑色殼長(zhǎng)牡蠣()為研究對(duì)象, 在自然海區(qū)與室內(nèi)環(huán)境分別暫養(yǎng)30 d后, 對(duì)長(zhǎng)牡蠣的殼色及殼表面細(xì)菌群落的多樣性和差異細(xì)菌功能進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 室內(nèi)養(yǎng)殖的黑殼長(zhǎng)牡蠣出現(xiàn)較為明顯的殼褪色現(xiàn)象, 其黑色素含量顯著下降, 遠(yuǎn)低于自然海區(qū)養(yǎng)殖的黑殼長(zhǎng)牡蠣。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示, 變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)為長(zhǎng)牡蠣殼表面的主要優(yōu)勢(shì)菌, 其中變形桿菌的豐度超過(guò)50%。在門(mén)水平上, 放線菌(Actinobacteria)、儉菌超門(mén)(Parcubateria)和Bacterial rice cluster 1(BRC1)在室內(nèi)、外養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣之間存在較為顯著的差異(<0.05), 而具有降解作用的放線菌和儉菌超門(mén)細(xì)菌在室內(nèi)養(yǎng)殖的黑殼長(zhǎng)牡蠣殼表面豐度較高。在屬水平上, 兩組之間存在顯著差異的細(xì)菌共計(jì)67種。該研究揭示了不同生境條件下, 黑殼長(zhǎng)牡蠣殼表面的微生物群落物種組成及差異, 為解析長(zhǎng)牡蠣殼色的形成機(jī)制提供了新的分析視角。

長(zhǎng)牡蠣(); 細(xì)菌群落; 高通量測(cè)序; 黑色素; 殼色

顏色多態(tài)性是指在自然環(huán)境中, 一個(gè)物種的不同或同一群體中不同個(gè)體呈現(xiàn)出兩種或兩種以上可遺傳的分離且不連續(xù)的顏色表型(Mckinnon, 2010)。貝殼顏色的不同會(huì)影響消費(fèi)者的選擇, 日常生活中, 消費(fèi)者更傾向于購(gòu)買顏色鮮艷的海產(chǎn)品(Brake, 2004)。研究發(fā)現(xiàn), 貝殼顏色的不同對(duì)軟體動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖、抗氧化等多個(gè)方面都會(huì)產(chǎn)生影響(Adzigbli, 2020)。Ge等(2015)發(fā)現(xiàn), 紫殼長(zhǎng)牡蠣家系的存活率顯著高于其他殼色。近年來(lái), 隨著軟體動(dòng)物選擇育種研究的發(fā)展, 貝殼顏色作為一種重要的性狀被廣泛應(yīng)用于多種軟體動(dòng)物的選育, 例如: 長(zhǎng)牡蠣(), 蝦夷扇貝()(Sun, 2015)、三角帆蚌()(Chen, 2017), 其中長(zhǎng)牡蠣已被成功選育出黑殼、紫殼、橙殼、金殼和白殼等多種殼色的新品系(Zhu, 2018)。

軟體動(dòng)物的殼色通常是因不同色素沉積所形成, 例如: 吡咯、黑色素、卟啉、膽汁素、類胡蘿卜素等, 其中黑色素的分布最為廣泛(Stemmer, 2014; Williams, 2017; Liu, 2020)。黑色素可以保護(hù)生物免受寄生蟲(chóng)、污染物、低溫、氧化應(yīng)激和紫外線的影響, 參與器官的發(fā)育調(diào)控, 具有極為重要的作用(Dubey, 2014)。黑殼長(zhǎng)牡蠣不僅外殼黑, 其外套膜及閉殼肌痕均呈現(xiàn)黑色, 富含黑色素, 具有較高的價(jià)值。研究表明, 高濃度雙酚A (Bisphenol A, BPA)暴露后, 富含黑色素的黑殼長(zhǎng)牡蠣組織未出現(xiàn)較為明顯的病理變化, 表明黑殼長(zhǎng)牡蠣與白殼長(zhǎng)牡蠣相比可能具有更強(qiáng)的免疫力(姜秋云, 2019)。

微生物在動(dòng)物的生存、生長(zhǎng)代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用(Bang, 2018)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 越來(lái)越多的研究采用高通量測(cè)序的方法從種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、群落多樣性與環(huán)境之間的協(xié)作關(guān)系等多個(gè)方面對(duì)微生物進(jìn)行研究。King等(2012)首次利用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)美洲牡蠣()腸道和消化腺內(nèi)的微生物種群組成進(jìn)行探究。目前高通量測(cè)序技術(shù)在雙殼貝類微生物多樣性研究的應(yīng)用主要集中在不同環(huán)境軟體動(dòng)物各組織微生物群落組成情況及差異細(xì)菌的作用分析(Madigan, 2014; Dubé, 2019; Horodesky, 2020); 致病菌對(duì)軟體動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的影響等方面(Labare, 1990; Stevick, 2019)。對(duì)雙殼貝類殼表面微生物的研究相對(duì)較少。已有的研究表明, 變形桿菌是雙殼貝類殼表面的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌, 美洲牡蠣殼表面微生物群落主要由α變形桿菌(Alphaproteobacteria)組成, 而加州貽貝()殼表面微生物則以γ變形桿菌(Gammaproteobacteria)為主(Pfister, 2014; Arfken, 2017)。

在黑殼長(zhǎng)牡蠣的繁育過(guò)程中發(fā)現(xiàn), 成體長(zhǎng)牡蠣(殼長(zhǎng)10—12 cm左右)經(jīng)過(guò)約30 d室內(nèi)養(yǎng)殖后, 其外殼表面顏色會(huì)變淺, 失去光澤, 出現(xiàn)殼褪色現(xiàn)象。在自然海區(qū)中養(yǎng)殖的黑殼長(zhǎng)牡蠣則未發(fā)生外殼褪色的現(xiàn)象(圖1)。一般而言, 不同的海區(qū)、不同的季節(jié)海洋水體理化性質(zhì)具有較大的差異, 水體中微生物組成和豐度隨季節(jié)等因素的變化有所改變(Wang, 2020)。受水環(huán)境的影響, 長(zhǎng)牡蠣殼表面微生物組成上可能存在較大的差異。本研究以海區(qū)正常養(yǎng)殖及發(fā)生褪色現(xiàn)象的黑殼長(zhǎng)牡蠣的殼表面微生物為研究對(duì)象, 對(duì)殼表面微生物的16S rRNA基因V3—V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序, 比較其微生物群落組成上的差異。從微生物多樣性的角度, 探究了長(zhǎng)牡蠣殼色的維持機(jī)制及褪色現(xiàn)象發(fā)生的原因。

圖1 黑殼與褪色黑殼長(zhǎng)牡蠣

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用黑殼長(zhǎng)牡蠣均來(lái)自于山東省長(zhǎng)島縣南長(zhǎng)山島連城灣海區(qū)養(yǎng)殖的個(gè)體選育家系。選取12只殼長(zhǎng)(10—12 cm)、殼寬(4—6 cm)、殼高(2—3 cm)無(wú)顯著差異的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨機(jī)挑選其中6只黑殼長(zhǎng)牡蠣轉(zhuǎn)入室內(nèi)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室, 使用50 L玻璃缸養(yǎng)殖, 定時(shí)投喂密度為5.0×105個(gè)/mL的優(yōu)質(zhì)金藻, 喂食后3 h內(nèi)換水一次, 養(yǎng)殖用海水取自山東省煙臺(tái)市周邊海區(qū); 另外6只則繼續(xù)在南長(zhǎng)山島海區(qū)中吊籠養(yǎng)殖。養(yǎng)殖期間, 自然海區(qū)及室內(nèi)環(huán)境的鹽度、溫度及pH如表1所示。養(yǎng)殖30 d后, 分別對(duì)自然海區(qū)養(yǎng)殖未褪色黑殼長(zhǎng)牡蠣樣本(B組), 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖褪色黑殼長(zhǎng)牡蠣樣本(F組)外殼表面微生物進(jìn)行取樣。取樣時(shí), 使用消毒棉簽蘸取牡蠣殼表面的微生物, 隨即將棉簽保存至2 mL的凍存管中, 置于-80 °C低溫冰箱保存。

表1 水環(huán)境基礎(chǔ)指標(biāo)

Tab.1 Basic indicators of water environment

1.2 殼色差異分析

利用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所用黑殼長(zhǎng)牡蠣外殼的光密度值(optical density values, ODV)進(jìn)行測(cè)量, 用以表征殼表面的顏色變化。將長(zhǎng)牡蠣外殼清洗干凈后, 使用數(shù)碼相機(jī)拍攝牡蠣殼照片。拍照時(shí), 在相機(jī)的兩邊放置同等功率的日光燈, 以去除陰影的影響。測(cè)量/計(jì)數(shù)/尺寸/比例調(diào)節(jié)器設(shè)置為牡蠣殼的輪廓, 選定測(cè)定區(qū)域, 進(jìn)行光密度的測(cè)定。強(qiáng)度校準(zhǔn)設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)光密度, 灰度值轉(zhuǎn)換為光密度值(ODV), 范圍從0 (完全白色)到2.0 (完全黑色)。

1.3 DNA的抽提與PCR擴(kuò)增測(cè)序

使用DNeasy?Power Water?Kit試劑盒(QIAGEN)進(jìn)行基因組DNA的提取, 利用1%的瓊脂凝膠電泳對(duì)基因組DNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。16S rRNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′)。反應(yīng)程序: 95 °C 30 min; 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 45 s, 27個(gè)循環(huán); 72 °C 10 min。PCR反應(yīng)體系如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)體系

Tab.2 PCR reaction system

利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量, 使用AxyPrep DNA膠回收試劑盒(Axygen Biosciences)切膠回收PCR產(chǎn)物, 最后使用Illumina MiSeq PE2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)分析

為減少干擾數(shù)據(jù)的存在, 對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行如下的預(yù)處理: (1) 數(shù)據(jù)質(zhì)控與優(yōu)化統(tǒng)計(jì), 使用Prinseq軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行控制, 去除序列長(zhǎng)度小于50 bp的短片段和低復(fù)雜度序列。使用FLASH軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接。(2) 去除嵌合體及靶區(qū)域外序列, 采用Mothur軟件進(jìn)行測(cè)序錯(cuò)誤的矯正及去除嵌合體的操作。(3) 操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)注釋, 提取優(yōu)化序列的非重復(fù)序列, 按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行聚類。(4) 分類學(xué)注釋, 利用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// www.arb-silva.de/版本號(hào): 132)進(jìn)行16S rRNA基因的比對(duì)。使用RDP classifier數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rdp.cme. msu.edu/misc/resources.jsp)進(jìn)行物種分類學(xué)分析, 統(tǒng)計(jì)在各分類水平下微生物群落的組成情況。

預(yù)處理完成后, 進(jìn)行如下的統(tǒng)計(jì)分析: (1) 使用Mothur軟件對(duì)微生物群落進(jìn)行Alpha多樣性分析。使用Shannon指數(shù)繪制稀疏曲線, 以反映測(cè)序量的合理性。(2) 使用Qiime軟件進(jìn)行Beta多樣性分析。(3) 利用Wilcox秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon rank-sum test)進(jìn)行組間顯著性差異檢驗(yàn), 使用FDR (false discovery rate)對(duì)值進(jìn)行校正。(4) 利用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)篩選出在兩組之間存在顯著性差異, 具有生物學(xué)意義的物種, 并估算每個(gè)物種所產(chǎn)生的影響。比較策略選擇all-against -all。(5) 基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析環(huán)境因素與殼表面微生物群落之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 殼色變化分析

ODV值的大小可間接反映黑殼表面的色素變化情況, 測(cè)定結(jié)果如圖2所示。B組長(zhǎng)牡蠣外殼表面的平均ODV值為0.68, F組長(zhǎng)牡蠣外殼表面的平均ODV值為0.34, B組平均ODV值是F組的2倍, 兩組樣本平均ODV值存在極顯著的差異(<0.01)。相比于自然海區(qū)養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣, 室內(nèi)養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣外殼顏色變淺, 出現(xiàn)較為明顯的褪色現(xiàn)象。

圖2 灰度對(duì)比確定殼體色素沉積的平均光密度值(ODV)

注: **表示兩組之間存在極顯著差異(<0.01)

2.2 細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

測(cè)序結(jié)果顯示, 有效序列數(shù)目在43 782—52 116之間, 序列平均長(zhǎng)度為417.20 bp。本次測(cè)序共獲得的4 728個(gè)OTU, 涵蓋43個(gè)門(mén), 99個(gè)綱, 199個(gè)目, 362個(gè)科、665個(gè)屬, 1 271個(gè)種。兩組樣本的平均覆蓋度(Coverage)均在98%以上, Coverage指數(shù)接近于1, 測(cè)序深度基本覆蓋樣本中的所有物種。Alpha多樣性指數(shù)可反映微生物群落的豐富度與均勻度, 常使用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)的大小表征。結(jié)果顯示: B組的Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)略高于F組, 而F組Simpson指數(shù)更高(表3)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)顯示, 兩組樣本的各Alpha多樣性指數(shù)之間無(wú)顯著性差異。稀疏曲線顯示, 隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加, 曲線逐漸趨于平緩, 當(dāng)測(cè)序數(shù)據(jù)量在10 000時(shí), 測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和(圖3)。上述分析結(jié)果表明, 兩組長(zhǎng)牡蠣殼表面微生物群落物種組成較為豐富, 微生物群落的豐富度、均勻度均較高。

表3 細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)

Tab.3 The alpha diversity index of bacterial communities

圖3 16S rRNA基因測(cè)序稀疏曲線

2.3 Beta多樣性分析

在OTU水平上, 基于Bray-Curtis距離算法, 利用非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)反映細(xì)菌群落的Beta多樣性。NMDS分析結(jié)果顯示, 組內(nèi)各個(gè)樣本點(diǎn)分布區(qū)域比較密集, 微生物群落結(jié)構(gòu)相似, 差異較小(圖4)。B組和F組的細(xì)菌形成了兩個(gè)不同的群落空間結(jié)構(gòu), Beta多樣性存在顯著差異(Stress=0.124,<0.01)。使用相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM), 探究?jī)山M樣本間的微生物群落組成的差異性。ANOSIM分析結(jié)果表明, 兩組樣本的組間差異明顯大于組內(nèi)差異, 兩組間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著(=0.307,<0.05)。上述分析結(jié)果顯示, B組與F組之間的微生物群落分布差異較大, 而分組內(nèi)的樣本差異較小。

圖4 非度量多維尺度分析(NMDS)

注: 圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品, 點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離表示樣品間物種組成差異程度, 同一顏色表示同一組的樣品。紫色圓點(diǎn)為黑殼(B組), 橙色三角為褪色黑殼(F組)

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析

Venn圖可以直觀的反映兩組樣本細(xì)菌群落OTU組成的差異性和重疊關(guān)系。兩組樣本微生物共有OTU數(shù)目為3 456 (圖5)。在B組中, OTU的數(shù)目共計(jì)4 130, 獨(dú)有OTU的數(shù)目674, 獨(dú)有OTU占B組OTU總數(shù)的16.32%。獨(dú)有OTU多隸屬于酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、儉菌超門(mén)(Parcubateria)等。在F組中, OTU數(shù)目共計(jì)4 054, 獨(dú)有OTU的數(shù)目為598, 獨(dú)有OTU占F組OTU總數(shù)的14.75%。F組獨(dú)有OTU多隸屬于變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、Latescibacteria菌及浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)等。從微生物的組成上看, 兩組之間獨(dú)有的OTU數(shù)目相對(duì)較少, 所占比例較小, 但分類較為豐富, 隸屬于多個(gè)細(xì)菌門(mén)類。

圖5 Venn圖分析結(jié)果

對(duì)長(zhǎng)牡蠣殼表面的微生物群落組成分析, 主要在門(mén)(phylum)和屬(genus)兩個(gè)分類學(xué)水平上展開(kāi)。門(mén)水平上, 微生物群落主要由10個(gè)細(xì)菌門(mén)組成, 各樣本中細(xì)菌豐度的差異如圖6a所示。變形桿菌是主要的優(yōu)勢(shì)菌, 在兩組樣本中的豐度超過(guò)50.00%, 且以α變形桿菌的紅桿菌科(Rhodobacteraceae)為主。擬桿菌門(mén)為第二優(yōu)勢(shì)菌, 在B組和F組中的豐度分別為19.70%和20.20%。其他優(yōu)勢(shì)菌如: 藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)及浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)等, 在樣本中的豐度均超過(guò)1.00%, 但豐度較低(表4)。

圖6 門(mén)水平(a)和屬水平(b)上各樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

表4 門(mén)水平優(yōu)勢(shì)菌的豐度

Tab.4 Abundance of phylum level dominant species

屬水平上, 豐度排名為前25的細(xì)菌豐度差異結(jié)果如圖6b所示。的豐度超過(guò)7.00%, 是主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。屬水平上, 兩組中豐度均超過(guò)1.00%的細(xì)菌有4種隸屬于變形桿菌門(mén), 它們分別是:、、和, 其中的豐度超過(guò)4.00%。細(xì)菌在兩組樣本中的豐度僅次于和(表5)。

表5 屬水平優(yōu)勢(shì)菌的豐度

Tab.5 Abundance of dominant species at genus level

續(xù)表

2.5 組間差異顯著性檢驗(yàn)

Wilcox秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示: 放線菌門(mén)、儉菌超門(mén)和Bacterial rice cluster 1 (BRC1)在兩組之間存在較為顯著的差異(<0.05)。放線菌門(mén)和儉菌超門(mén)的細(xì)菌在F組的豐度極顯著高于B組的豐度(<0.01), 且放線菌門(mén)和儉菌超門(mén)細(xì)菌的豐度之間存在極顯著的相關(guān)性(< 0.01)。而B(niǎo)RC1菌則在B組的豐度(0.03%)顯著高于F組(0.01%)(<0.05)。皮爾遜相關(guān)分析表明, 放線菌門(mén)、儉菌超門(mén)細(xì)菌的豐度與黑色素含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)性(<0.05), BRC1細(xì)菌的豐度與黑色素的含量無(wú)明顯的相關(guān)性。

屬水平上, 67個(gè)屬在兩組間存在顯著性差異(<0.05), 其中有19個(gè)屬在兩組間存在極顯著性差異(<0.01)。如圖7所示, 屬水平上, 平均豐度處于前25的細(xì)菌, 有7種在兩組之間存在顯著差異, 其中、、、、在F組中豐度較高, 與B組存在較大差異。B組中, 玫瑰變色菌屬()、的豐度較高, 與F組存在顯著差異(<0.05)。除此之外, 科爾維爾氏菌屬()在B組的豐度顯著高于F組, 其相對(duì)豐度僅次于。、和細(xì)菌豐度與長(zhǎng)牡蠣黑色素含量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(<0.05)。其他幾種差異細(xì)菌的豐度與長(zhǎng)牡蠣黑色素含量之間無(wú)顯著的相關(guān)性。在兩組中, 存在顯著差異的細(xì)菌屬多隸屬于變形桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、浮霉菌門(mén)及擬桿菌門(mén)等, 變形桿菌門(mén)是豐度最高的細(xì)菌。在兩組樣本中豐度較高的物種, 比如:菌、和則在兩組樣本中不存在顯著性差異。

圖7 兩組樣本差異分析

注: **表示兩組之間存在極顯著差異(< 0.01), *表示兩組之間存在顯著差異(< 0.05)

LDA分布柱狀圖表明: 當(dāng)LDA閾值設(shè)定為3.00時(shí), 兩組樣本間共有17個(gè)物種的豐度存在顯著差異(<0.05)(圖8)。B組中、科爾維爾氏菌屬、玫瑰變色菌屬和等細(xì)菌分值較高, 其中的LDA分值最大(LDA=3.75), 產(chǎn)生的影響較大。F組的、、、等細(xì)菌的分值較高, 與B組存在顯著差異(<0.05),是LDA分值最大的細(xì)菌(LDA=3.88)。

圖8 LDA分布柱狀圖

2.6 環(huán)境因素對(duì)微生物群落的影響

利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)反映微生物群落與水體環(huán)境之間的正負(fù)相關(guān)性。如圖9所示: 屬水平上, 相對(duì)豐度在前25的細(xì)菌中, 有5種細(xì)菌豐度與水體環(huán)境之間存在相關(guān)性。、、、、與鹽度和溫度之間存在顯著的正相關(guān), 與pH之間存在顯著的負(fù)相關(guān)(<0.05)。而與pH之間存在顯著的正相關(guān), 與鹽度和溫度則呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(<0.05)。

3 討論

研究表明, 外殼表面沉積不同種類的色素使貝類呈現(xiàn)出多彩的顏色。外殼表面黑色素的沉積使長(zhǎng)牡蠣呈現(xiàn)黑色(Williams, 2017)。本實(shí)驗(yàn)所用長(zhǎng)牡蠣富含黑色素, 不僅外殼黑, 外套膜和閉殼肌痕均呈現(xiàn)黑色。目前, 對(duì)于長(zhǎng)牡蠣黑色素的發(fā)生機(jī)制尚未有明確的結(jié)論。Yu等(2017)的研究表明, 視黃醛脫氫酶、酪氨酸酶和細(xì)胞色素P450等基因家族可能在長(zhǎng)牡蠣黑色素沉積過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

已有對(duì)長(zhǎng)牡蠣微生物群落的研究多集中在不同組織之間。在長(zhǎng)牡蠣鰓、外套膜和血淋巴中, 變形桿菌為主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌; 而消化腺中變形桿菌、擬桿菌及放線菌的豐度較高(Fernández, 2014; Lokmer, 2016)。針對(duì)牡蠣殼表面微生物的研究相對(duì)較少。例如: Arfken等(2017)發(fā)現(xiàn), 美國(guó)大西洋沿岸的美洲牡蠣()殼表面微生物群落組成主要以α變形桿菌中的鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)、Erythrobacteraceae科和紅桿菌科(Rhodobacteraceae)為主。在韓國(guó)沿海廢棄牡蠣殼表面, 變形桿菌所占比例達(dá)到了41%, 其次為擬桿菌(36.4%), 厚壁菌(Firmicutes)所占比例不足10%(Math, 2010)。本研究顯示, 兩種不同環(huán)境中的長(zhǎng)牡蠣殼表面的主要優(yōu)勢(shì)菌同樣為變形桿菌門(mén), 其豐度超過(guò)50%, 以α變形桿菌為主。變形桿菌是海洋細(xì)菌中最重要的類群, α變形桿菌占海洋微生物總數(shù)的10%左右(Park, 2014; 張作峰等, 2020)。并且山東煙臺(tái)周邊海域海洋水體中α變形桿菌亦是第一優(yōu)勢(shì)菌(張艷, 2010)。因此, 長(zhǎng)牡蠣所處水體環(huán)境與殼表面優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的組成具有極大的相似性。

圖9 水體性質(zhì)與微生物群落之間的相關(guān)性

注: **表示兩組之間存在極顯著差異(< 0.01), *表示兩組之間存在顯著差異表示(< 0.05)

進(jìn)一步的分析顯示, 在微生物群落的組成上, 兩種水體環(huán)境中長(zhǎng)牡蠣殼表面的微生物群落組成上存在一定差異。門(mén)水平上, BRC1細(xì)菌在B組的豐度遠(yuǎn)高于F組, 而放線菌門(mén)和儉菌超門(mén)在F組的豐度更高。

BRC1細(xì)菌廣泛存在于富含有機(jī)物的環(huán)境中(Kadnikov, 2019), 目前尚未成功培養(yǎng)出BRC1細(xì)菌門(mén)的菌株, BRC1細(xì)菌的具體功能尚不清晰, 仍需進(jìn)一步的研究。在F組中, 放線菌所占比例達(dá)到了6.14%, 約是B組的兩倍。放線菌廣泛存在于各種環(huán)境中, 具有強(qiáng)大的生物合成潛力, 能夠產(chǎn)生具有較強(qiáng)抗菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。放線菌還具有降解有機(jī)物的作用, 其產(chǎn)生的水解酶可降解各種生物聚合物, 例如: 纖維素、木聚糖和幾丁質(zhì), 在氮碳循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用(Manivasagan, 2013; Fernández, 2014)。除放線菌外, 在F組的長(zhǎng)牡蠣殼表面發(fā)現(xiàn), 儉菌超門(mén)的豐度(2.19%)高于B組(1.20%)。儉菌超門(mén)細(xì)菌的基因組幾乎都在1 Mb以下, 缺乏能量代謝的關(guān)鍵基因。因此, 儉菌超門(mén)細(xì)菌無(wú)法單獨(dú)生活, 需要與其他微生物共生生活, 例如放線菌等(Nelson, 2015)。相關(guān)性分析結(jié)果表明, 儉菌超門(mén)與放線菌的豐度存在極顯著的相關(guān)性(<0.01)。儉菌超門(mén)的部分細(xì)菌同樣具有降解功能, 可以降解環(huán)境中的纖維素和甲殼素(Nelson, 2015; 陶曄等, 2020)。長(zhǎng)牡蠣殼中的黑色素不溶于水, 與蛋白質(zhì)、多糖等生物聚合物結(jié)合緊密(何成等, 2017)。F組中, 放線菌和儉菌超門(mén)細(xì)菌的大量聚集可能促進(jìn)了長(zhǎng)牡蠣殼表面生物聚合物的降解過(guò)程, 從而發(fā)生了殼褪色現(xiàn)象。

門(mén)水平上, 存在顯著差異的細(xì)菌的數(shù)目較少, 多數(shù)細(xì)菌的豐度無(wú)較大的差異。屬水平上, 差異細(xì)菌的數(shù)目較多, 超過(guò)50個(gè)屬在兩組之間存在顯著的差異。相比于F組, 玫瑰桿菌屬、科爾維爾氏菌屬和在B組長(zhǎng)牡蠣黑殼表面的豐度均較高。

玫瑰桿菌屬?gòu)V泛存在于各種海洋介質(zhì)中, 比如海水、沉積物、海冰等。玫瑰桿菌屬通過(guò)脫甲基途徑和裂解途徑將海洋中的有機(jī)硫化物二甲基疏基丙酸內(nèi)鹽(Dimethylsulfoniopropionate, DMSP)代謝分解, 參與硫循環(huán)(Sun, 2016)。在本次測(cè)序中, 玫瑰桿菌屬在B組的豐度為1.64%, 高于F組的1.00%。推測(cè)其可能的原因是水體環(huán)境的不同造成細(xì)菌豐度的差異?？茽柧S爾氏菌屬是嗜冷菌, 在海冰、極地沉積物、深海海溝中均有發(fā)現(xiàn)(Nogi, 2004)?？茽柧S爾氏菌屬具有降解碳?xì)浠衔锏淖饔? 在溢油環(huán)境中, 可大量檢出(Gutierrez, 2013; Mason, 2014)與科爾維爾氏菌的作用相似, 同樣具有降解碳?xì)浠衔锏淖饔谩８缓細(xì)浠衔锏某练e物中菌的豐度和多樣性都會(huì)升高(Guibert, 2012; Hestetun, 2015)。

在南長(zhǎng)山島養(yǎng)殖的黑殼長(zhǎng)牡蠣殼表面, 科爾維爾氏菌和的豐度均高于室內(nèi)養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣?？赡苁怯捎谕庠此w的排放, 導(dǎo)致渤海灣水體中的碳?xì)浠衔锖枯^高, 促進(jìn)了具有降解功能細(xì)菌的繁殖, 例如科爾維爾氏菌和。因此, 水體環(huán)境可能對(duì)細(xì)菌的豐度產(chǎn)生較大的影響。然而, 由于科爾維爾氏菌屬和屬細(xì)菌難以獨(dú)立培養(yǎng), 在長(zhǎng)牡蠣殼色維持方面所起到的作用尚不明確, 仍需進(jìn)一步的探索。

微生物群落的組成是動(dòng)態(tài)的, 受地理環(huán)境的影響較大, 隨鹽度、溫度、pH值等環(huán)境因素的變化而變化(Prieur, 1990; Harris, 1993; Jing, 2019)。自然海區(qū)養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣生活環(huán)境復(fù)雜多變, 在潮汐、波浪等風(fēng)力或水力的作用下, 水體不斷混合, 水體微生物處于不斷的變化之中。皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果表明, 在兩組樣本中存在顯著差異細(xì)菌的豐度與水體環(huán)境之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。其中、、、、細(xì)菌的豐度與鹽度和溫度之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系, 與pH之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(<0.05)。而細(xì)菌的豐度與pH之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系, 與鹽度和溫度則呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(< 0.05)。因此, 環(huán)境條件與微生物豐度之間相關(guān)性較強(qiáng), 并可影響微生物的豐度。

4 結(jié)論

與自然海區(qū)相比, 室內(nèi)養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣發(fā)生了殼褪色現(xiàn)象, 且黑色素含量顯著下降。殼表面微生物多樣性分析表明, 兩種環(huán)境中養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣微生物群落在種類組成上無(wú)較大的差異, 但是細(xì)菌的豐度有所不同。變形桿菌門(mén)是長(zhǎng)牡蠣殼表面微生物群落的主要優(yōu)勢(shì)菌, 其豐度在兩組中超過(guò)50%。褪色黑殼長(zhǎng)牡蠣表面具有降解作用的細(xì)菌豐度較高, 例如放線菌門(mén)和儉菌超門(mén), 推測(cè)其可能參與長(zhǎng)牡蠣殼褪色過(guò)程, 環(huán)境條件的不同可影響長(zhǎng)牡蠣殼表面細(xì)菌的豐度。本研究從微生物多樣性的角度, 解析了黑殼長(zhǎng)牡蠣殼表面褪色現(xiàn)象的可能原因。

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MICROBIAL DIVERSITY ON SURFACE OF BLACK-SHELL

LI Ling-Ling, XIE Chao-Yi, SONG Hong-Ce, CHEN Xi, LIU Wen-Juan, HUANG Bao-Yu, ZHANG Mei-Wei, LIU Ya-Qiong, WEI Lei, WANG Xiao-Tong

(School of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, China)

To explore the effects of natural water and indoor environment on the shell color and bacterial community diversity of molluscs, the melanin-richwas cultured in the natural water and indoor environment for 30 days. The diversity of bacterial community structure and the function of different bacteria on the shell color and shell surface of thewas analyzed. Results show that the black-shelledcultured indoor showed obvious shell fading phenomenon and the melanin content was significantly decreased, which was much lower than the black-shelledcultured in natural water. 16S rRNA gene sequencing showed that Proteobacteria, Bacteroidetes, and Cyanobacteria were the main dominant bacteria on the surface ofshells and the abundance of Proteobacteria exceeded 50%. At the phylum level, Actinobacteria, Parcubateria, and Bacterial rice cluster 1 (BRC1) were significantly different between the two groups (< 0.05). Among them, the Actinobacteria and Parcubateria bacteria with degrading effect was relatively high in the surface abundance of the black-shelledgrown indoor. At the genus level, there were 67 species of bacteria with significant differences between the two groups. This study revealed the species composition and differences of the microbial community on surface of oyster shell under different habitat conditions, and provided a new analytical perspective for the oyster shell color manipulation.

; bacterial community; high-throughput sequencing; melanin; shell color

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 41906088號(hào); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 41876193號(hào); 山東省高等學(xué)?！扒鄤?chuàng)科技計(jì)劃”, 2019KJF004號(hào); 山東省貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系, SDAIT-14號(hào)。李玲玲, 碩士研究生, E-mail: lilingling0603@126.com; 并列第一作者: 謝超伊, 碩士研究生, E-mail: 2433040312@qq.com

魏 磊, 副教授, E-mail: lei819@126.com; 王曉通, 教授, E-mail: wangxiaotong999@163.com

2021-04-06,

2021-06-08

S917

10.11693/hyhz20210400082