郭席君，譚怡平，郭研，陳思源，李玲

湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州 425199

近年來(lái)多肽藥物的開(kāi)發(fā)成本降低、周期縮短，研究進(jìn)展越來(lái)越快，當(dāng)下已有80余種多肽藥物上市。其中，胸腺五肽通過(guò)促進(jìn)和誘導(dǎo)T細(xì)胞分化與成熟等途徑來(lái)影響免疫系統(tǒng)[1]，目前被用于治療多種自身免疫性疾病。脾氨肽主要對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫發(fā)揮作用，提高T細(xì)胞的活性。但是，胸腺五肽和脾氨肽在體內(nèi)微環(huán)境下不穩(wěn)定，存留時(shí)間短，生物利用度低，并且多數(shù)治療自身免疫疾病的藥物不具備特異性識(shí)別先天性和獲得性免疫反應(yīng)的能力，毒副作用較強(qiáng)[2]。因此，對(duì)免疫多肽藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造，載體運(yùn)輸?shù)?，?shí)現(xiàn)多肽藥物在體內(nèi)的長(zhǎng)效性與靶向治療和提高生物利用度，具有重要的臨床意義。

目前胸腺五肽和脾氨肽相關(guān)的藥物在市面上多種多樣，利用多肽自組裝設(shè)計(jì)，研制結(jié)構(gòu)類似物和衍生物；選用細(xì)胞穿透肽（CPP）類藥物載體，增加多肽細(xì)胞吸收率和靶向性；共軛PEG類聚合物，增加多肽藥物的生物利用度。該文對(duì)前期研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，在多肽免疫活性、合成設(shè)計(jì)、藥物載體、靶向優(yōu)化和長(zhǎng)效性等方面綜述該聯(lián)合藥物的前景。

1 多肽的免疫活性

1.1 細(xì)胞免疫

T細(xì)胞是細(xì)胞免疫中十分關(guān)鍵的物質(zhì)，Th17細(xì)胞為T輔助細(xì)胞中的一個(gè)新亞群,是由Th0細(xì)胞在細(xì)胞因子IL6和IL23的條件下分化而成的輔助性T細(xì)胞,它可分泌細(xì)胞因子。Th17細(xì)胞在自身免疫病及抗感染免疫中,能夠分泌白細(xì)胞介素21，形成白細(xì)胞介素21自分泌環(huán)，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并引起組織損傷[3]。在以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療中，對(duì)T細(xì)胞功能各亞群的準(zhǔn)確識(shí)別很關(guān)鍵，一般采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+水平[4]。蔡儀術(shù)等[5]用脾氨肽治療可以有效糾正lgE合成分泌紊亂、增強(qiáng)患者的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)脾氨肽可有效緩解小兒支氣管哮喘的胸悶咳嗽等癥狀。

在胸腺發(fā)育成熟的T細(xì)胞進(jìn)入外周血中介導(dǎo)細(xì)胞免疫，在機(jī)體免疫方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。韓慧[6]研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘研究組患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），IgE水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）,研究組的有效率明顯高于實(shí)驗(yàn)組。

T細(xì)胞亞群在機(jī)體抗病毒細(xì)胞免疫過(guò)程中起促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變?cè)街?，CD3總T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD8抑制/殺傷T細(xì)胞計(jì)數(shù)以及CD4輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)越低[7]。蘇賀[8]研究發(fā)現(xiàn)胸腺五肽對(duì)惡性腫瘤患者T細(xì)胞亞群有影響。研究結(jié)果顯示兩組治療后CD3+和CD3+、CD4+水平顯著提高，而CD3+、CD4+、CD8+、CD25+明顯降低，且觀察組組中CD3+、CD4+、CD8+的增長(zhǎng)速度更顯著。臧雪鋒等[9]在研究中表明胸腺五肽利于改善急性腎損傷患者的免疫功能，證明了其T細(xì)胞在免疫功能障礙方面的治療作用。

1.2 刺激巨噬細(xì)胞分化

巨噬細(xì)胞的功能取決于內(nèi)環(huán)境。作為免疫功能細(xì)胞調(diào)節(jié)的一部分，胸腺五肽能刺激未分化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，使其具有良好的細(xì)胞攝取滯留性能，用以保證在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮正常生理功能[10]。從組成上看，胸腺五肽含有Arg、Lys、Asp、Val、Tyr 5種氨基酸，具有胸腺生成素Ⅱ的全部生理功能；在正常機(jī)體狀態(tài)下，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，可促進(jìn)各種炎性因子的分泌，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成熟，增強(qiáng)B細(xì)胞的功能，促進(jìn)Ig G、Ig A、Ig M類型抗體的分泌等[11]。

2 多肽的自組裝合成

自組裝合成多肽技術(shù)，即從多肽的結(jié)構(gòu)探究到設(shè)計(jì)組裝，到實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽手性自組裝結(jié)構(gòu)進(jìn)行精準(zhǔn)多級(jí)調(diào)控的技術(shù)，是進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)多肽功能化應(yīng)用的基礎(chǔ)。在我國(guó)自組裝多肽設(shè)計(jì)處于研發(fā)起步階段，由于發(fā)展前景好,近年來(lái)的研究成果取得了許多的新進(jìn)展。Liu等[12]合成了一種由48個(gè)氨基酸組成的能夠自組裝并具有抗腫瘤活性的多肽，且包含能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的肽段KLA，該活性肽為RADA-KLA。HuK等[13]在α-螺旋多肽自組裝新模式及其在儲(chǔ)能方面應(yīng)用的研究中取得了新進(jìn)展。

除了自組裝和修改分子功能基外，多肽還可以分為幾個(gè)片段。多肽具有良好的細(xì)胞相容性，可進(jìn)行合理設(shè)計(jì)和精確剪裁，分成幾個(gè)片段肽鏈。周建華等[14]將特立帕肽序列中的34個(gè)氨基酸分成4個(gè)片段，以Wang Rein(王樹(shù)脂）和CTC Resin(2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂）為固相載體分別獲得4個(gè)片段的全保護(hù)肽。隨著多肽的合成與設(shè)計(jì)技術(shù)的日趨完善，現(xiàn)有研究成果，為探索設(shè)計(jì)出一類同時(shí)具有調(diào)節(jié)成熟T細(xì)胞和促進(jìn)輔助T細(xì)胞活性等功能，對(duì)機(jī)體免疫力進(jìn)行多方位精準(zhǔn)調(diào)控的多肽奠定了基礎(chǔ)。

受先天免疫反應(yīng)的啟發(fā)，李明明等[15]模仿天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)合理設(shè)計(jì)多肽序列，并進(jìn)行自組裝合成，獲得了一種短肽可以精確預(yù)防過(guò)敏或調(diào)節(jié)自身免疫疾病，并且這種短肽已經(jīng)被應(yīng)用于多種癌癥的免疫治療。

3 多肽用作藥物載體

3.1 藥物載體

由于多肽納米材料的藥物遞送系統(tǒng)具有良好的生物相容性和較低的毒副作用，自組裝肽類藥物載體可用于改善藥物特性，具有緩釋和靶向的作用。但是由于受其結(jié)構(gòu)、親水性、極性的影響，多肽難以透過(guò)細(xì)胞膜，影響吸收。近年來(lái)細(xì)胞穿透肽(CPP)在核酸、聚合物、脂質(zhì)體、納米粒子和低分子量藥物等各種藥物載體中運(yùn)用甚廣。它具有很強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透性，通過(guò)細(xì)胞表面的特異性受體識(shí)別，將藥物核酸等特異性傳遞至細(xì)胞內(nèi)部。這些多肽易于合成表征，能夠共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合生物活性藥物，通過(guò)內(nèi)吞作用輸送到細(xì)胞內(nèi)使基因表達(dá)[16]。見(jiàn)圖1。

圖1 CPP負(fù)載藥物用于細(xì)胞內(nèi)傳送

將新合成的多肽置于CPP內(nèi)部，由CPP將多肽分子輸送于細(xì)胞中，明顯提高了多肽分子的靶向性和水溶性。CPP穿膜肽是一種小分子多肽，它富含精氨酸和賴氨酸，通?？梢耘c蛋白、核酸等在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生生物活性的生物大分子相連，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、反轉(zhuǎn)微團(tuán)模式等不同機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，使得多肽可以像小分子藥物一樣能夠穿過(guò)細(xì)胞膜，作用于細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)發(fā)揮功能[17]。其中使用最廣泛的兩種陽(yáng)離子CPP是由TAT介導(dǎo)的多肽和包含9個(gè)精氨酸的寡聚精氨酸多肽構(gòu)成[18]。細(xì)胞穿膜肽TAT是一類能攜帶多肽等大分子物質(zhì)穿過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的短肽，核心序列由11個(gè)氨基酸組成，由2個(gè)獨(dú)立的外顯子編碼，第1個(gè)外顯子編碼前72為氨基酸，具有轉(zhuǎn)錄激活活性[19]。自從TAT發(fā)現(xiàn)以來(lái)，許多肽經(jīng)常被添加到CPP上，包括人工合成的多聚精氨酸R9[15]。王浩等[20]用具有細(xì)胞穿透功能的Hsp-Tat納米粒作為siRNA新型遞送載體，該納米粒具有良好的生物相容性及高效siRNA復(fù)合特性，可將siRNA高效遞送進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，是一種高效且安全系數(shù)高的運(yùn)輸載體。王中山等[21]利用TAT構(gòu)建NR2Pep的原核表達(dá)系統(tǒng)，NR2Pep是NMDA受體2B亞基羧基端來(lái)源的多肽，得到較高純度的NR2Pep，在體外證實(shí)它具有穿過(guò)不同細(xì)胞膜的活性。

3.2 靶向性

理想的藥物分子是高藥效性、低毒性和強(qiáng)靶向性等性質(zhì)為一體的高綜合性藥物分子。提高藥物的靶向性將明顯地降低藥物的毒副作用。靶向性已成為衡量一種藥物是否優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，但由于大多數(shù)的多肽細(xì)胞滲透能力差，無(wú)法精確識(shí)別用藥部位，需要對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或利用一些高滲透性的小肽來(lái)改善多肽的細(xì)胞滲透能力。THP是一種腫瘤微環(huán)境中存在的小肽，它可以修飾包裹藥物的納米顆粒表面，將藥物靶向輸送至腫瘤組織中[23-23]。多肽藥物的靶點(diǎn)最主要的是G蛋白偶聯(lián)受體，拓?fù)錁?gòu)象為7次跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的受體，通過(guò)與配體相互作用，使其分子構(gòu)象發(fā)生變化，產(chǎn)生信號(hào)傳遞。它在現(xiàn)代的多肽藥物研發(fā)中占據(jù)重要地位，大約有50%的藥物采用它作為藥物靶點(diǎn)。

整合素親和肽RGD是一種含有Arg-Gly-Asp的三肽，普遍存在于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中，是整合素蛋白識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)具有信號(hào)分子傳遞功能,可作用于體內(nèi)多種具有生理活性的反應(yīng)[24]。鄭延延等[25]用丙烯酸等離子體處理將RGD整合到PEEK上，見(jiàn)圖2。將多肽藥物融合到RGD可實(shí)現(xiàn)多肽藥物腫瘤靶向性的目的[26]。崔梅英等[27]研究顯示RGD-ELPs融合蛋白具有較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞黏附作用，黏附細(xì)胞的數(shù)量與蛋白質(zhì)濃度成正比。可依據(jù)此原理,將聯(lián)合胸腺五肽與脾氨肽設(shè)計(jì)出的多肽整合到小分子靶向肽RGD中,提高該復(fù)合多肽在機(jī)體內(nèi)的靶向性。在腫瘤治療中，為了提高腫瘤細(xì)胞的靶向性,篩選腫瘤中高特異性受體和配體，進(jìn)行人工合成和設(shè)計(jì)序列，構(gòu)建靶向功能肽段。邱敏[28]設(shè)計(jì)合成了一個(gè)疏水性2-氨基十六烷酸N-羧基內(nèi)酸酐（APA-NCA）單體，從而構(gòu)建了一系列多功能聚脂肽膠束和囊泡納米平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子抗癌藥物的腫瘤靶向遞送。還可選擇免疫應(yīng)答反應(yīng)中特異性高表達(dá)的受體作為靶標(biāo)，制備融合多肽藥物的靶向功能多肽。

圖2 等離子體處理PEEK表面和化學(xué)鍵合RGD肽的過(guò)程示意圖

4 多肽藥物長(zhǎng)效性

由于多肽在體內(nèi)微環(huán)境下易降解，延長(zhǎng)多肽藥物半衰期是目前多肽藥物的研究重點(diǎn)。常用PEG修飾和聚多肽融合技術(shù)提高多肽及蛋白質(zhì)藥物的半衰期。PEG修飾劑可與多肽多個(gè)部位的氨基、羧基、羥基和巰基進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)減少代謝和體循環(huán)中受體介導(dǎo)的對(duì)蛋白質(zhì)的吸收，達(dá)到降低血漿清除率。在不同環(huán)境下PEG修飾產(chǎn)物的異構(gòu)體均有差異，可采取酶催化PEG定位修飾的方法，對(duì)β-LG的Gln殘基進(jìn)行定點(diǎn)修飾，可最大限度地提高多肽的生物學(xué)利用效率[29]。PEG修飾磁性納米粒子后，可增加血液循環(huán)時(shí)間，增加藥物傳遞系統(tǒng)的滯留時(shí)間[30]。聚多肽融合技術(shù)相比PEG修飾，避免了體外化學(xué)偶聯(lián)和修飾后純化步驟，具有生物可降解性，可避免在細(xì)胞和器官中蓄積,一般是通過(guò)增加分子大小或改變電荷性質(zhì)來(lái)減少腎清除，延長(zhǎng)藥物半衰期[31]，見(jiàn)圖3。趙市超等[32]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)聚合物修飾過(guò)的GO熱穩(wěn)定性明顯提高。

圖3 聚多肽融合技術(shù)延長(zhǎng)半衰期的原理示意圖

5 結(jié)論

多肽藥物具有選擇性強(qiáng)、特異性高和毒副作用低的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，在研究抵抗各種由于免疫力低下而引起的癌癥等疾病的治療藥物中多肽藥物受到廣泛關(guān)注。但由于多肽藥物的自身缺陷導(dǎo)致目前上市的多肽類藥物并不多。未來(lái)，可以在多肽分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行研究，克服無(wú)靶向性和藥效低的缺陷，具體將現(xiàn)有多肽先導(dǎo)物進(jìn)行官能團(tuán)優(yōu)化，結(jié)合生物信息學(xué)和高通量組合化學(xué)等方法進(jìn)行有效和合理的設(shè)計(jì)與改造，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)作用時(shí)間長(zhǎng)、特異靶向性和高活性的目標(biāo)。