張二芹 潘佳佳 陳紅英 張同旭

摘要 生物制品的質(zhì)量關(guān)系到人類和動物的健康，而蛋白純化是生物制品的質(zhì)量保證，因此通過課堂教學(xué)、實(shí)驗操作和考核方式，學(xué)生掌握蛋白純化的基本策略和方法，其目的讓學(xué)生做到學(xué)以致用，為研發(fā)單位和企業(yè)培養(yǎng)一批應(yīng)用型人才。

關(guān)鍵詞 動物醫(yī)學(xué)制藥專業(yè);生物制品;蛋白純化;教學(xué)方法

中圖分類號 S-01?? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）21-0277-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.072

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Exploration of Protein Purification Teaching Reform in Animal Medicine and Pharmaceutical Specialty

ZHANG Er-qin， PAN Jia-jia， CHEN Hong-ying et al

（College of Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， National Animal Immunology International Joint Research Center， Zhengzhou， Henan 450046）

Abstract The quality of biological products is related to human and animal health， and protein purification is the quality guarantee of biological products.Therefore， students can master the basic strategies and methods of protein purification? through classroom teaching， experimental operations and assessment methods， the purpose of which is to enable students to apply what they have learned and cultivate a batch of application-oriented talents for research and development units and enterprises.

Key words Animal medicine and pharmaceutical specialty;Biological products;Protein purification;Teaching methods

基金項目 轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08001006-010）。

作者簡介 張二芹（1976—），女，河南焦作人，副教授，博士，從事動物免疫研究。

收稿日期 2021-03-29

生物制品在預(yù)防和治療人類和動物傳染病方面作出了巨大的貢獻(xiàn)，如流感疫苗、豬瘟血清、流感HA重組蛋白、細(xì)胞因子IL-2和IFN（干擾素）、蛋白酶、犬瘟熱單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品、體外免疫診斷制品等[1]。然而這些生物制品大多數(shù)是從生物材料中提取或者通過表達(dá)系統(tǒng)（真核或原核）獲得的，除了目的蛋白外，還包括許多生物材料和表達(dá)系統(tǒng)（包括培養(yǎng)基）雜蛋白，其中有些雜蛋白對人和動物產(chǎn)生不良反應(yīng)（如過敏反應(yīng)）[2]，并且影響目的蛋白的活性和使用劑量，因此為了獲得具有高度安全、高效、易保存和低成本工廠化生產(chǎn)等特點(diǎn)的生物制品，必須對生物制品進(jìn)行純化，使生物制品活性、安全以及純度達(dá)到臨床應(yīng)用級別。

蛋白純化工藝是生物制品加工的下游環(huán)節(jié)，也是生物制藥企業(yè)最重要的生產(chǎn)環(huán)節(jié)。所以，為了獲得更優(yōu)質(zhì)的生物產(chǎn)品、為了適應(yīng)當(dāng)前生物制品發(fā)展的需要，為生物制藥企業(yè)和相關(guān)科研院所培養(yǎng)高質(zhì)量的學(xué)生，該研究從教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)實(shí)訓(xùn)和教學(xué)方法等[3]方面進(jìn)行生物制品教學(xué)以及加強(qiáng)學(xué)生對生物制品的后期純化的工藝教學(xué)和實(shí)驗的培養(yǎng)等方面探索進(jìn)行總結(jié)。

1 蛋白純化工藝教學(xué)實(shí)驗改革必要性

隨著自然環(huán)境和社會環(huán)境的改變，人類和動物的新老舊病不斷的出現(xiàn)，如2018年以來非洲豬瘟[4]、2019—2020年全球新冠肺炎[5]、2020年美國暴發(fā)的乙型H1N1流感[6]，以及世界各地暴發(fā)的禽流感H5N1、H5N6和H5N8等[7]重大傳染病。這些傳染病對人類和動物造成極大的危害，因此亟需對這些重大傳染病及時采取防控和治療措施，研發(fā)診斷試劑盒、制備疫苗和單克隆抗體等。生物技術(shù)的發(fā)展，疫苗、抗體和細(xì)胞因子等生物制品研究時間大大地縮短，隨之也在不斷地更新?lián)Q代，但對蛋白質(zhì)量和純度也要求越來越高。為了在短時間內(nèi)獲得高純度的生物制品，為了讓制藥學(xué)生適應(yīng)新形勢的發(fā)展需求，為社會培養(yǎng)應(yīng)用型人才，因此對河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)制藥專業(yè)學(xué)生的抗原分離與純化教學(xué)提出了新的要求，并且要精選蛋白純化工藝教學(xué)改革內(nèi)容。

2 蛋白純化工藝教學(xué)改革的主要內(nèi)容

蛋白質(zhì)純化技術(shù)和方法的發(fā)展已經(jīng)成為許多生物技術(shù)進(jìn)步的必要先決條件，所以為了激發(fā)本科生學(xué)習(xí)蛋白純化的濃厚興趣，蛋白純化內(nèi)容從幾個方面進(jìn)行改革。

2.1 蛋白純化的重要性

從生物材料中分離蛋白或者利用基因工程方法獲得蛋白，研究其結(jié)構(gòu)與功能，了解生命活動的規(guī)律、各種生物相互之間關(guān)系，制備重大傳染病的疫苗、研發(fā)抗體及抗病毒藥物等具有重要的科學(xué)意義。2019年Wang等[8]解析了非洲豬瘟（ASFV）晶體結(jié)構(gòu)，2020年Yao等[9]解析了新冠肺炎病毒（COVID-19）的晶體結(jié)構(gòu)，這為今后研究蛋白的功能、制備疫苗及篩選抗體奠定基礎(chǔ);在生物研究領(lǐng)域，應(yīng)用酶如蛋白酶、RNA酶、DNA酶和連接酶等為實(shí)驗的順利進(jìn)行提供了有力保障;食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)需要活性酶，為人們的生活提供方便;在醫(yī)療方面，干擾素、細(xì)胞因子IL-2、單抗以及基因工程苗等為人類和動物的健康作出了重大貢獻(xiàn)。通過給學(xué)生介紹蛋白純化技術(shù)在病毒、各種酶以及生物藥品等領(lǐng)域應(yīng)用，讓學(xué)生認(rèn)識到純化蛋白的重要性，引導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)純化蛋白的興趣。

2.2 蛋白純化的策略及原則

為了讓學(xué)生盡快掌握蛋白純化方法，首先了解蛋白純化策略和原則[10]：制備的生物產(chǎn)品用途;原材料的選擇;處理原材料的條件;根據(jù)應(yīng)用確定產(chǎn)品的純度;除去對人或動物有害物質(zhì)和過敏原以及依據(jù)需求，確定產(chǎn)品的純化規(guī)模等。使學(xué)生在上課期間，帶著問題認(rèn)真聽講，加深對純化知識的理解。同時在準(zhǔn)備純化的過程當(dāng)中，要讓學(xué)生明白純化的蛋白純度、生物活性和數(shù)量;掌握目標(biāo)蛋白和關(guān)鍵雜質(zhì)的性質(zhì)，簡化技術(shù)選擇和優(yōu)化;提前準(zhǔn)備快速檢測蛋白活性/回收率和臨界污染物的方法;減少每個階段的樣品處理時間，保持抗原活性;減少添加物;盡早除去有害物質(zhì)（生物材料中的蛋白酶，可能降解目的蛋白）;依據(jù)層析技術(shù)的特性，進(jìn)行組合，除去雜質(zhì);減少純化步數(shù)，提高產(chǎn)品的回收率，縮短純化時間。循循善誘的方式引發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性。

2.3 緩沖液對蛋白結(jié)構(gòu)和活性的影響

蛋白質(zhì)氨基酸殘基的化學(xué)完整性（如Asn去酰胺化和Met氧化）和蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的維持都高度依賴于溶液的pH。因此用緩沖試劑來控制pH和優(yōu)化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，常用緩沖液包括三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、醋酸、檸檬酸和甘氨酸液等，pH為3～10。在已知的溶液pH下，不同的緩沖離子會對蛋白質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性和構(gòu)象穩(wěn)定性產(chǎn)生特定的離子效應(yīng)，在自然界中既有穩(wěn)定作用，也有破壞作用。例如，不同的緩沖溶液會影響干擾素和粒細(xì)胞集落刺激因子的物理化學(xué)穩(wěn)定性。如檸檬酸多價羧酸緩沖液可以影響溶解度，并導(dǎo)致單抗在高蛋白濃度下形成凝膠，眾所周知，Tris（三羥甲基氨基甲烷）和磷酸鹽溶液的pH會分別隨溫度或冷凍而改變。鹽影響蛋白質(zhì)構(gòu)象的完整性和穩(wěn)定性[11]。舉例說明緩沖試劑對蛋白結(jié)構(gòu)和活性的影響，促使學(xué)生鞏固學(xué)過的專業(yè)理論知識，主動參與蛋白純化方案制作，練習(xí)DoE（Design of Experiment）試驗設(shè)計，在今后的實(shí)驗中能認(rèn)真分析、思考，提高解決問題的能力。

2.4 填料對蛋白純化的影響

蛋白色譜層析是將目的蛋白從復(fù)雜的蛋白溶液中分離出來。常用的色譜層析包括離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾層析和反相層析（表1）。離子交換層析根據(jù)蛋白表面凈電荷的不同進(jìn)行分離蛋白;疏水層析和反向?qū)游龆际且罁?jù)蛋白的疏水性的不同分離蛋白，只是反向?qū)游鎏盍系谋砻嫱ǔ１仁杷盍细邮杷?親和層析是以一個蛋白與特異性配基配對到色譜填料上，并且與配基具有可逆性的相互作用，如抗原和抗體;凝膠過濾層析也稱為分子篩，根據(jù)蛋白分子量的大小分離蛋白。每種填料依據(jù)顆粒大小和分辨率又分為許多種類，以Q陰離子填料為例，填料顆粒越大，分標(biāo)率越低，相反，填料顆粒越小，分辨率越高。生產(chǎn)這些填料的公司有中國的博格隆生物技術(shù)有限公司和納微科技有限公司，美國的GE公司和BIO-RAD公司，日本的TOSOH公司等。大多數(shù)純化方案都涉及多種形式的色譜層析法，因此色譜層析已經(jīng)成為蛋白純化必要工具。不同的色譜層析技術(shù)具有不同的選擇性，可以形成強(qiáng)大的組合用于任何生物分子的純化，以最大限度地提高產(chǎn)量和減少所需的步驟。學(xué)生根據(jù)蛋白純化需要組合不同的色譜層析，才能達(dá)到自己想要的蛋白純度。理想情況下，蛋白純化過程[10]包括樣品制備、萃取和澄清（透析過濾和超濾）以及蛋白純化的3個環(huán)節(jié)，即蛋白捕獲、中間純化和精細(xì)純化（圖1）。在捕獲階段，分離、集中和穩(wěn)定目標(biāo)產(chǎn)品;在中間純化階段，去除大部分的雜質(zhì)，如其他蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素和病毒;在精細(xì)純化階段，去除任何剩余的痕量雜質(zhì)或密切相關(guān)的物質(zhì)來達(dá)到高純度。因此讓學(xué)生掌握每個環(huán)節(jié)目的不同，除掉的雜物也不相同，只有3個環(huán)節(jié)的填料最佳組合，才是保證快速方法開發(fā)以及較短時間獲得純產(chǎn)品的關(guān)鍵。

3 教學(xué)實(shí)訓(xùn)

獸醫(yī)生物制品學(xué)是一門應(yīng)用性學(xué)科，學(xué)生須將課本上學(xué)的純化理論知識與生產(chǎn)實(shí)踐結(jié)合起來，才能更好地融會貫通。所以課堂實(shí)驗操作[12-13]練習(xí)之前，回顧蛋白純化目的和意義、純化策略以及蛋白純化遵循原則，如建立蛋白純化快速的檢測方法、不同填料之間的如何搭配等。實(shí)驗課上給定已知蛋白，讓學(xué)生學(xué)會使用分子生物學(xué)軟件，分析蛋白的性質(zhì)，自己設(shè)計試驗，挑選緩沖液和試劑，裝填料柱，進(jìn)行手動操作練習(xí)蛋白純化，初步掌握蛋白純化流程;其次教師組織學(xué)生到科研單位（動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室）觀看蛋白純化自動化儀器操作過程，認(rèn)識純化儀器AKTA、過濾儀器以及離心機(jī)等儀器，學(xué)會使用儀器，帶著問題進(jìn)行仔細(xì)觀察教師和博士生純化蛋白的整個流程，加深認(rèn)知蛋白純化工藝;最后帶領(lǐng)學(xué)生參觀生物制品制造企業(yè)，了解生物制品規(guī)?；a(chǎn)，實(shí)地觀察蛋白純化工藝放大過程，逐步地從課堂理論知識過渡到實(shí)驗室基本操作過程以及進(jìn)一步了解蛋白純化自動化操作流程，讓學(xué)生更深一步掌握蛋白純化一系列工藝流程，真正做到學(xué)以致用，為研發(fā)單位和企業(yè)培養(yǎng)一批批應(yīng)用型人才。

4 教學(xué)手段與方法

4.1 課堂教學(xué)

通過上課講解，首先讓學(xué)生獲得大量的純化蛋白知識理論，及時進(jìn)行提問，與學(xué)生進(jìn)行互動，把理論知識掌握的更牢固，充分提高教學(xué)效率。其次教師每天要查閱大量的新知識，及時給學(xué)生補(bǔ)充新內(nèi)容。課堂上列舉生活中經(jīng)常應(yīng)用的藥物或者蛋白，例如流感HA蛋白、豬瘟E2蛋白

和白蛋白等，講解這些蛋白的純化過程，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和熱情。同時借助多媒體教學(xué)，添加一些圖片、動畫以及蛋白純化視頻，豐富教學(xué)內(nèi)容，吸引學(xué)生的注意力，學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題，課堂當(dāng)場解決，提高學(xué)生積極主動學(xué)習(xí)的樂趣[14-15]。

4.2 網(wǎng)絡(luò)教學(xué)

2020年受新冠肺炎的影響，大中小學(xué)生不能走進(jìn)教室進(jìn)行正常上課，為了不耽誤學(xué)生學(xué)習(xí)的進(jìn)程，國家主張“停課不停學(xué)”政策，所以在特殊時期，網(wǎng)絡(luò)教學(xué)[16-18]成為另一種教學(xué)方式。在網(wǎng)上開課之前，教師們紛紛響應(yīng)國家的號召，錄制網(wǎng)絡(luò)視頻，或者通過超星、金課建設(shè)、釘釘和騰訊視頻直播給同學(xué)們上課。學(xué)生能在上課時間準(zhǔn)時聽課和學(xué)習(xí)，通過視頻與教師們進(jìn)行互動交流、討論問題，也可以下載課件回放多次聽課，彌補(bǔ)課堂中的不足，起到了加深理解、解惑問題的作用。同時教師在網(wǎng)絡(luò)上布置作業(yè)，再次鞏固當(dāng)天學(xué)習(xí)的知識。為了讓學(xué)生充分利用現(xiàn)代化信息技術(shù)，教師給學(xué)生介紹一些生物制品相關(guān)的網(wǎng)站如生物谷和中國生物技術(shù)網(wǎng)，學(xué)生利用課余時間瀏覽網(wǎng)站，可以查看各種期刊發(fā)布的新內(nèi)容、新技術(shù)和新方法，如新冠、非洲豬瘟和流感疫苗等的不同制備方法、免疫保護(hù)效果，調(diào)動學(xué)生主動學(xué)習(xí)新知識、新內(nèi)容的積極性。

4.3 學(xué)生考核方式

為了讓學(xué)生在短時間內(nèi)掌握抗原純化方法，提高學(xué)生的分析能力、動手能力以及主動解決問題的能力，對學(xué)生的實(shí)驗技能按照百分制進(jìn)行考核，例如純化水稻中的新城疫F蛋白[19]，進(jìn)行百分制考核[20]（表2）。總之對學(xué)生進(jìn)行多方面考核，既鍛煉學(xué)生的思考、動手以及解決問題的能力又體現(xiàn)了學(xué)生們團(tuán)結(jié)合作精神。

5 總結(jié)

生物藥物的品質(zhì)關(guān)系到人類和動物安全，蛋白的純度決定生物品質(zhì)，這充分說明蛋白純化的重要性，因此嘗試著通過教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)實(shí)訓(xùn)以及教學(xué)方法改革蛋白純化的內(nèi)容，讓學(xué)生掌握蛋白純化的意義、純化蛋白遵循的原則以及不同填料的組合和應(yīng)用，使得學(xué)生在蛋白純化技術(shù)方面得到全面的鍛煉，也為制藥專業(yè)學(xué)生今后發(fā)展和就業(yè)奠定了基礎(chǔ)。

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