彭碧寧 曾川 鐘藝園 潘亮 蔡德玲

摘要 [目的]建立一種利用氨基酸分析儀分析鑒定醬油中皮革水解蛋白標志物羥脯氨酸的方法。[方法]選用 4-羥基-α-吡咯甲酸為參考物質，利用氨基酸自動分析儀法和紫外分光光度計法對醬油中L-羥脯氨酸的含量進行測定，比較這2種檢測方法測定羥脯氨酸的優(yōu)劣點。[結果]紫外分光光度法在羥脯氨酸的質量濃度為1～6 mg/L與吸光度之間線性關系良好（R2=0.998 0），RSD為0.91%，分別添加 0.5、2.0、6.0 mg/L羥脯氨酸標準溶液的加標回收率為90.0%～93.8%。氨基酸分析儀法在羥脯氨酸質量濃度為0.5～30.0 mg/L與峰面積之間線性關系良好（R2=0.999 3），RSD為 0.75%，分別添加 0.5、10.0、20.0 mg/L羥脯氨酸標準溶液的加標回收率為96.8%～99.7%。[結論]氨基酸分析儀法自動化程度好，重現性和準確度較好，適用于醬油中是否添加動物皮革水解蛋白的鑒定和檢測，為食品安全監(jiān)管提供可靠的技術支持。

關鍵詞 氨基酸分析儀法;皮革水解蛋白標志物;羥脯氨酸;醬油摻假;紫外分光光度法

中圖分類號 TS 264.2+1? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）21-0202-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.052

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Identification of Hydrolyzed Protein Reagent Protein-Hydroxyproline in Soy Sauce Using Amino Acid Analyzer

PENG Bi-ning? ZENG Chuan? ZHONG Yi-yuan2 et al

（1. Technical Center of Gongbei Customs District P.R. China， Zhuhai，Guangdong? 519000;2.Lishui Branch of Nanhai Market Supervision Administration， Foshan，Guangdong 528200）

Abstract [Objective]To set a method for the identification of the hydrolyzed protein marker-hydroxyproline in soy sauce using an amino acid analyzer. [Method]Using 4-hydroxy-α-pyrrolecarboxylic acid as the reference substance，the content of L-hydroxyproline in soy sauce was determined by the automatic amino acid analyzer method and the ultraviolet spectrophotometer method，and the advantages and disadvantages of the two detection methods for the determination of hydroxyproline were compared.[Result]The UV spectrophotometry showed a good linear relationship between the mass concentration of hydroxyproline 1-6 mg/L and the absorbance （R2=0.998 0）， the RSD was 0.91%，and the recoveries of standard addition of 0.5， 2.0， 6.0 mg/L hydroxyproline standard solution were 90.0%-93.8%.Amino acid analyzer method had a good linear relationship between the mass concentration of hydroxyproline 0.5-30.0 mg/L and the peak area （R2=0.999 3）， the RSD was 0.75%，the spiked recovery rates of 0.5， 10.0， and 20.0 mg/L hydroxyproline standard solutions were 96.8%-99.7%.[Conclusion] The amino acid analyzer method has good automation， good reproducibility and accuracy. It is suitable for the identification and detection of whether to add animal leather hydrolyzed protein in soy sauce， and provides reliable technical support for food safety supervision.

Key words Amino acid analyzer method;Leather hydrolyzed protein marker;Hydroxyproline;Soy sauce adulteration;UV spectrophotometry

作者簡介 彭碧寧（1983—），女，廣東佛山人，工程師，在讀碩士，從事食品安全研究。

收稿日期 2021-01-11

醬油是我國傳統的調味品，因其用途廣泛，營養(yǎng)成分豐富，廣受人們的喜愛。醬油調味品出現方興未艾的增長勢頭，市場競爭也日趨激烈。醬油的主要原料經過曲霉、酵母和氨基酸多種微生物的降解作用，產生一系列的生化反應，構成了營養(yǎng)豐富、風味獨特的醬油制品，這種便稱為釀造醬油。而配制醬油是以釀造醬油為主體，允許在一定的范圍內添加酸水解植物蛋白的液體調味品。

醬油的釀造成本并不會很高，但由于許多非法企業(yè)希望獲得更大的經濟收益，便利用摻假醬油（在醬油中偷偷摻入動物水解蛋白）代替高品質的釀造醬油。非法商販使用動物蛋白質如動物內臟和殘羹剩飯生產水解蛋白質來制造摻假醬油，甚至發(fā)酵垃圾、頭發(fā)、皮鞋的下腳料以產生氨基酸，表面上達到釀造醬油的蛋白質質量檢驗標準。事實上，產生的氯丙醇將對人們造成嚴重傷害[1]。為保證醬油相關產品的質量，如何檢測醬油是否添加了動物水解蛋白迫在眉睫。

目前檢測羥脯氨酸基本使用紫外分光光度計法[2-6]。國家食品標準 GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》也是利用紫外分光光度計法[7]。而氨基酸分析儀法大多用來檢測乳及乳制品是否添加動物水解蛋白的鑒定[8-11]。氨基酸自動分析儀尚未有較大普及范圍，其費用較高，而且存在需要較多緩沖液，普通實驗室難以實現，比較局限于精密檢測研究的實驗室。而且目前針對研究利用氨基酸分析儀法鑒定醬油制品的羥脯氨酸的文獻和科學試驗非常少。筆者選用 4-羥基-α-吡咯甲酸為參考物質，采用氨基酸自動分析儀法和紫外分光光度計法2種檢測方法對醬油中L-羥脯氨酸的含量進行測定，并研究這2種方法的精密度、加標回收率、優(yōu)劣點、異同點等，探討對羥脯氨酸的鑒定在區(qū)分摻假醬油中的應用價值[12]。

1 氨基酸分析儀法試驗部分

1.1 試驗原理 醬油中的蛋白質被鹽酸水解成游離氨基酸，經離子交換柱分離后，與茚三酮溶液反應生成顯色反應，然后用氨基酸分析儀測定游離氨基酸含量。羥脯氨酸是肌肉膠原蛋白（動物氨基酸）的主要成分之一，其含量為正常膠原蛋白的13.4%，在彈性蛋白中含量較低。L-羥脯氨酸不存在于其他蛋白質中，包括植物水解蛋白質;它被認為是膠原蛋白中的特征性氨基酸。羥脯氨酸有L-羥脯氨酸和 D-羥脯氨酸2種，但D-羥脯氨酸在自然界中不存在。因此，L-羥脯氨酸含量的檢測已成為衡量動物氨基酸存在的重要指標。所以，一旦在醬油中檢測出羥脯氨酸，就可以認為醬油添加了動物水解蛋白。

1.2 儀器

高速氨基酸自動分析儀（L-8900，日本日立公司）;全自動氮吹濃縮儀（TurboVapⅡ，美國Caliper公司）;電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;分析天平（Sartorius BT224S型，德國賽多利斯公司）;安瓿瓶（山西宏光醫(yī)藥公司）;酒精噴燈（福州北玻實驗儀器公司）;高純氮氣瓶（山東天海有限公司）。

1.3 試劑

羥脯氨酸（4-羥基-α-吡咯甲酸），北京恒業(yè)中遠化工有限公司;茚三酮溶液，日本和光純藥工業(yè)公司;MCIL-8500 緩沖溶液（L-8500-PH-KIT 和 L-8500-PF-KIT），三菱化學公司;鹽酸、乙醇均為分析純，廣州化學試劑廠。樣品稀釋液：1∶600 HCL溶液。5%乙醇溶液：在1 L的容量瓶中加入900 mL的蒸餾水，再加入50 mL的乙醇，充分混勻。所用水為超純水。

1.4 試驗步驟

1.4.1 稱樣。稱取一定量的醬油（精確至0.000 1 g）于潔凈安瓿瓶中或者使用200 μL的移液槍吸取醬油于安瓿瓶中。

1.4.2 水解。稱取樣品后，加入6 mol/L的鹽酸溶液至安瓿瓶的2/3處，將安瓿瓶口置于酒精噴燈最高溫處灼燒封口。隨后將其放入110 ℃的電熱恒溫干燥箱內，水解22 h，取出，冷卻室溫。

1.4.3 稀釋。利用磨砂片將水解好的安瓿瓶打開，將溶液轉移至50 mL的比色管中，并用純凈水定容至50 mL，混勻。

1.4.4

濃縮。取 1 mL上述樣品稀釋液至氮吹管中，置于自動氮吹濃縮儀中吹干。氮吹儀的溫度設置為 60 ℃。氮吹是為了將6 mol/L的鹽酸吹干，因為氨基酸分析儀有不同pH的梯度洗脫流程，水解時所加的 6 mol/L鹽酸濃度過高，會導致分析出來的數據有較大誤差，并且氮吹的過程可以將氨基酸進行濃縮。

1.4.5

上機分析。加入2 mL的樣品稀釋液，將其調至與緩沖溶液接近的pH。經 0.22 μm水相濾膜過濾，備用上機分析。

1.5 儀器條件

色譜柱為4.6 mm×60 mm填充柱，陽離子樹脂填充;色譜柱溫度57 ℃;反應器溫度135 ℃;第1通道檢測波長570 nm;第2通道檢測波長440 nm;進樣體積20 μL;分析時間53 min。

該試驗改進的分析程序見表1。使用53 min分析程序，這樣較充分地完成對分離柱的洗脫、再生、平衡效果，也較好地保證了對氨基酸的分離效果，又大量地節(jié)省了價格昂貴的茚三酮試劑，僅使用原用量的1/10。壓力泵1和泵2色譜圖見圖1。

2 結果與分析

2.1 前處理及儀器條件的優(yōu)化

按照 GB 5009.124—2016標準方法中鹽酸水解的試驗步驟是用水解管冷凍后充氮氣封口，于110 ℃水解22 h。但在實際操作過程中發(fā)現，使用上述方法密封性不好，甚至在水解的過程中，水解管中的液體極易泄露出來，造成鹽酸的揮發(fā)和烘箱的腐蝕。于是該試驗優(yōu)化水解的試驗步驟，利用酒精噴燈在高溫灼燒時對安瓿瓶進行密封封口。

氨基酸分析儀的分析程序設置和緩沖液的配制是試驗的關鍵之一，該試驗受緩沖液的pH影響較大，pH的不同可能會導致最后的分析色譜圖的差異。將緩沖液按說明書中的配方配制好后，應用0.22 μm水相濾膜過濾，以免緩沖液中的雜質堵塞氨基酸分析儀的細小管路。日立L-8900原來的分析程序并不能把每種氨基酸完全分離，所以必須進行優(yōu)化B1、B2、B3、B4的切換時間。通過一系列的微調程序，調整出最適宜的分析程序。

2.2 羥脯氨酸標準曲線的繪制

稱取100 mg羥脯氨酸標準品至100 mL容量瓶中，加超純水定容，搖勻待用。吸取上述配制好的羥脯氨酸標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，加超純水定容，待上儀器分析。以羥脯氨酸濃度（mg/L）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。由圖2可知，羥脯氨酸線性回歸方程為y=33 247x+3 645.8（R2=0.999 3），在羥脯氨酸質量濃度為0.5～30.0 mg/L時與峰面積之間有良好的線性關系。羥脯氨酸標準溶液色譜圖見圖3。

2.3 精密度分析

使用配制好的1 mg/mL羥脯氨酸標準溶液，吸取1.5 mL于100 mL容量瓶中，稀釋搖勻。分別取2 mL上述配制好的15 mg/L的標準溶液稀釋液于6個進樣瓶中。平行測定6個進樣瓶。分析得出峰面積RSD為0.75%，表明氨基酸分析儀試驗方法的精密度良好。

2.4 加標回收率 分別取3種不同品牌的醬油樣品，根據“1.4”試驗步驟，分別測定樣品中羥脯氨酸含量。再在測定完成后的樣品中分別在樣品1、2、3中添加1 mg/mL的羥脯氨酸標準溶液250.00、0.50、1.00 mL，樣品加標后再稀釋10倍。最后使加標樣品溶液的濃度分別為0.5、10.0、20.0 mg/L。依次進行上機分析測定，每個樣品做3次平行試驗。試驗結果見表 加標回收率為96.8%～99.7%，平均加標回收率為98.4%。

2.5 實際樣品測定

分別取市售不同品牌的醬油樣品，按“1.4”方法進行處理后上機分析，分別用該試驗的氨基酸分析儀法和參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》紫外分光光度計法測定醬油樣品中羥脯氨酸含量，得到的數據見表3。1號醬油樣品和2號醬油樣品色譜圖見圖4。

為了更準確判斷氨基酸自動分析儀法數據和紫外分光光度計法數據的差異性，選擇了羥脯氨酸含量較高的魚膠原蛋白肽粉進行2種方法的測定。結果顯示，紫外分光光度計法測定魚膠原蛋白肽粉中羥脯氨酸含量為13.588 μg/mL，使用氨基酸自動分析儀法測定魚膠原蛋白肽粉中羥脯氨酸含量為15.681 μg/mL。從上述試驗結果可知，無論是羥脯氨酸含量高低，相同樣品使用氨基酸分析儀檢測值高于紫外分光光度計法檢測值。氨基酸分析儀的精密度和加標率均比紫外分光光度計好，其測定結果更為準確。魚膠原蛋白肽粉 VIS2 整體色譜圖見5。

2.6 輔助鑒定

根據文獻[13]報道，釀造醬油和配制醬油在氨基酸組成成分上有明顯的差異，所以利用氨基酸自動分析儀確定氨基酸組分的比例關系，不僅可以檢測其中是否含有羥脯氨酸，還可以作為區(qū)分釀造醬油和非釀造醬油鑒別體系的方法之一，有效打擊市場以次充好的現象。

以2號醬油樣品為例，利用氨基酸自動分析儀檢測出16種氨基酸數據見表 這16種氨基酸均在第1通道檢出。由表4可知，醬油中谷氨酸的含量較高，而半胱氨酸最低，天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸含量在谷氨酸和半胱氨酸之間。與文獻[14]報道的相符，這些氨基酸特征指標及比例關系可輔助判別醬油中是否含有皮革水解蛋白標志物——羥脯氨酸。2號醬油樣品VIS1整體色譜圖見圖6。

3 結論與討論

該研究建立了一種利用氨基酸自動分析儀分析鑒定醬油中皮革水解蛋白標志物羥脯氨酸的方法。通過改進食品標準中測定氨基酸的前處理水解試驗步驟以及優(yōu)化儀器條件，設計了醬油中羥脯氨酸檢測的試驗流程。同時通過紫外分光光度計法進行驗證，確定氨基酸自動分析儀測定的數據是有效可信的。

氨基酸自動分析儀可實現羥脯氨酸與其他氨基酸完全洗脫分離，保留時間與醬油中的其他氨基酸不重疊，同時也能測定和分析醬油中其他水解氨基酸。該方法準確，對比其他方法前處理過程更為簡便，自動化程度高，無須專人觀察儀器的運轉情況，靈敏度高，精確度高，變異系數小，能避免氨基酸衍生物的多樣性，能夠快速地測定羥脯氨酸的含量。該方法具有良好的線性關系、精密度以及回收率。但是氨基酸自動分析儀成本較高，維護費用較為昂貴，會限制中小型企業(yè)和基層實驗室的使用。

在醬油的生產過程中，如嚴格按照強制性國家標準 GB/T 2717—2003《醬油衛(wèi)生標準》[15] 和 GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[16]的規(guī)定執(zhí)行，則不存在食品超標、微生物污染等的安全性問題。但是非法商販會使用水解蛋白制造醬油，所以對此類醬油的鑒別是十分必要的。目前市面上的醬油僅從檢測氨基酸態(tài)氮是否達到了國家標準來衡量醬油的品質，要對其來源進行鑒定，可以對醬油的氨基酸組分進行分析，進一步地確定醬油是否摻假。

在檢測摻假的過程中不能單一用羥脯氨酸檢測標準，這樣不具有可靠性。而是需要結合醬油中含氯化合物、氨基酸組成成分分析、羥脯氨酸含量、香味成分指紋圖譜、銨鹽含量分析、過氧化值等方面的分析，形成一個聯合特征指標標準的鑒別體系。同時要打擊醬油摻偽日益嚴重的現象，不僅需要有關檢測方法的不斷改進，還需有關政府部門加大執(zhí)法力度，加強對生產廠家的監(jiān)管，嚴懲不法商販，才能有效地解決人為添加皮革水解物造成的醬油安全性問題[17]。

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