李 芳，王海蘋，狄建英，香秋梅，王 倩，楊 賡，魏 盛

（1.北京市豐臺區(qū)婦幼保健院，北京 100069；2.金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 濟南 250101；3.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院急診危重癥中心，北京 100029；4.山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點實驗室，山東 濟南 250355）

舒郁膠囊是名老中醫(yī)張珍玉教授研發(fā)的治療抑郁癥之肝郁氣滯證的處方，由柴胡、白芍、香附、甘草組成，具有疏肝解郁、調(diào)暢情志的作用[1-2]。課題組前期實驗證實舒郁膠囊在治療抑郁癥肝氣郁證、郁怒情緒等情感障礙方面有著獨特的作用[3-4]，但舒郁膠囊發(fā)揮該中樞作用的具體有效成分、主要靶點和作用環(huán)節(jié)均不明確。有研究表明5-HT3受體拮抗劑有抗焦慮和抗抑郁作用[5]，能夠增強5-羥色氨再攝取抑制劑的抗抑郁樣作用[6]，但5-HT3R介導的離子通道功能影響抑郁癥抑郁情緒的機制尚不明確。針對這些關鍵問題，筆者運用LC-ESI-MS技術對舒郁膠囊給藥后大鼠海馬的吸收成分和代謝產(chǎn)物進行化學成分辨識。同時，本實驗復制了抑郁情緒模型大鼠并用舒郁膠囊進行干預，以含藥血清作為細胞給藥方式，以5-HT3R蛋白表達及通路電流改變?yōu)檠芯繉ο螅噲D從5-HT3R功能水平尋找舒郁膠囊調(diào)節(jié)抑郁癥抑郁情緒的作用靶點和作用機制。

1 材 料

1.1 藥物與試劑 氟西?。ǘY來蘇州制藥有限公司，批號：H20110742）；柴胡提取物（柴胡提取率為20%，即5 g生藥提取出1 g提取物）、舒郁膠囊（新藥臨床批件2008L11169）和白芍提取物（芍藥苷含量35%）均由青島海川創(chuàng)新生物天然藥物研究中心提供。

芍藥苷標準品（批號：110736-2005030）、柴胡皂苷A標準品（批號：110777-201208）、柴胡皂苷D標準品（批號：110778-201208）（中國食品藥品檢定研究院）；5-HT3R激動劑phenylbiguanide（Sigma公司，貨號：164216）；5-HT3AR一抗（Abcam公司，貨號：ab51950）；5-HT3A二抗（Abcam公司，貨號：ab16248）；5-HT3BR一抗（Santa Cruz公司，貨號：sc-51198）；5-HT3B二抗IgG-HRP（Santa Cruz公司，貨號：sc-2020）；乙腈（德國Merck公司，LC-MS級）；甲醇（美國Thermo Fisher公司，LC-MS級）；甲酸（美國Sigma Aldrich Fluka公司，LC-MS級）。

1.2 主要儀器 Multiclamp 700B膜片鉗放大系統(tǒng)（美國MDC公司）；電泳儀、蛋白印跡轉(zhuǎn)移裝置（美國伯樂公司）；Agilent 1100 series液相色譜儀系統(tǒng)（美國Agilent公司）；XRXvideo曠場監(jiān)控裝置（上海欣軟信息科技有限公司）；Agilent XCT plus型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀系統(tǒng)（美國Agilent公司）；Micropipette puller P97微電極拉制儀（美國Sutter公司）。

1.3 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠64只，體質(zhì)量160～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2002-0003；新出生24 h內(nèi)的SPF級Wistar大鼠，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2011-0003。大鼠進入實驗室在溫度（23±2）℃和40%～60%濕度環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周，動物實驗設計均經(jīng)過山東中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：DWSY2017 03013，動物實驗操作遵從美國NIH頒布《實驗動物護理和使用指南》。實驗中取材腦組織的大鼠采用心臟灌流法處死，其余大鼠采用頸椎脫臼法處死。

2 方 法

2.1 HPLC-ESI-MSn法的色譜條件和質(zhì)譜檢測 色譜柱：Kromasil C18100 R（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2%冰醋酸（V/V）水溶液（A）和乙腈（B）；柱溫：30 ℃；流動相洗脫梯度：0～6 min，2%～5%B；6～12 min，5%～12%B；12～28 min，12%～15%B；28～43min，15%～25%B；43～56min，25%～34%B；56～70 min，35%～40%B；70～81 min，40%～65%B；81～90 min，65%～100%B；流速：1 mL/min，進樣量：20 μL。質(zhì)譜檢測條件：負離子掃描模式，霧化氣（N2）壓力：40.0 psi，離子源溫度：350 ℃，掃描范圍（m/z）：100～1400，電離源電壓：3.5kV，多級質(zhì)譜碰撞電壓：1V。

2.2 大鼠腦組織樣品制備及檢測 將24只雄性Wistar大鼠隨機分為4組，每組6只，分別灌胃給予純凈水[5 mL/（kg·d）]、舒郁膠囊內(nèi)容物[0.41 g/（kg·d）]、柴胡提取物[0.32 g/（kg·d）]和白芍提取物[36 mg/（kg·d）]，連續(xù)灌胃4 d。將第4天灌胃后的大鼠，用生理鹽水心臟灌流，冰上分離大鼠海馬、額葉、下丘腦、紋狀體、小腦和腦干，置于-80 ℃冰箱備用。將各腦核團分別精密稱質(zhì)量并記錄，勻漿，沉淀蛋白，渦旋1 min，在4 ℃條件下離心20 min（15 000 g）。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈EP管中，吹干，復溶，渦旋，高速離心15 min，吸取20 μL上清液，利用HPLC-ESI-MS進樣分析。

2.3 抑郁情緒模型大鼠及含藥血清制備 采用曠場實驗和糖水偏好實驗[7]選取得分相近的大鼠40只，隨機分為4組，每組10只。（1）正常對照組，給予純凈水，5 mL/（kg·d），簡稱正常組；（2）抑郁情緒模型組，進行28 d孤養(yǎng)結(jié)合慢性溫和刺激[8]，同時給予純凈水，5 mL/（kg·d），簡稱抑郁組；（3）舒郁膠囊組，按“（2）”項中方法進行抑郁情緒造模，同時給予舒郁膠囊，0.41 g/（kg·d），簡稱舒郁組；（4）氟西汀組，按“（2）”項中方法進行抑郁情緒造模，同時給予氟西汀，10 mg/（kg·d）（相當于成人臨床8倍劑量）。每天灌胃給藥2次，造模28 d完成后即進行模型評價（曠場實驗、糖水偏好實驗結(jié)合宏觀行為藥理學觀察）。末次灌胃給藥90 min后[9]，麻醉并腹主動脈取血，靜置30 min后高速離心，合并同組血清分裝放置于-80 ℃冰箱，使用時將血清常溫解凍，滅活并用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.4 培養(yǎng)及孵育海馬神經(jīng)元原代細胞 取新出生24 h內(nèi)的Wistar大鼠，無菌分離海馬組織，37 ℃培養(yǎng)箱0.125%胰酶消化15 min，終止消化，清洗，將上清液滴加在被多聚賴氨酸包被好的細胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)4 h，輕搖，清洗，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，更換為配制好的不含血清的培養(yǎng)基，并置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d換液1次（每次半量更換）。于第8天細胞培養(yǎng)基中分別加入正常組血清、抑郁組血清、舒郁組血清及氟西汀組血清至最終體積分數(shù)為10%，然后繼續(xù)培養(yǎng)24h，用Western blotting方法檢測5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達，利用全細胞膜片鉗技術記錄5-HT3受體激動劑加入后介導的離子通道電流。

2.5 Western blotting法檢測海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3A/3B受體的蛋白表達 將含血清（10%）培養(yǎng)基孵育24 h后的海馬神經(jīng)元原代細胞分組裂解，提取裂解后的神經(jīng)元總蛋白，其中每組取10 μL用BCA法做蛋白含量檢測，其余使蛋白變性分裝后置于-20℃冰箱備用。取10μL室溫融化后的備用樣品，經(jīng)SDSPAGE電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜。將NC膜裝入孵育袋并加入已經(jīng)稀釋好的相應anti-5-HT3A（1∶200）一抗和anti-5-HT3B（1:5 000）一抗，封口，孵育4 ℃過夜；洗膜3次，然后放入孵育袋并分別加入相應anti-5-HT3A（1∶400）二抗和anti-5-HT3B（1∶400）二抗，封口，室溫孵育2 h；洗膜3次，顯影和定影檢測雜交信號。5-HT3A/3B受體的相對表達量為其與內(nèi)參β-actin的灰度比值。

2.6 全細胞膜片鉗技術記錄5-HT3受體門控離子通道電流 在電壓鉗模式下記錄5-HT3R通道電流，所充電極內(nèi)液成分和灌流用外液成分參考文獻記錄，鉗制電壓為-70 mV，微電極電阻3～5 Mohm，濾波器濾波頻率為2.9 kHz，采樣頻率為20 kHz[10]。通過細胞旁Y管快速灌流方式給予PBG（phenybiguanide，10 μmol/L）和其他各組滅活后的血清，在倒置顯微鏡下通過微電極操縱儀控制電極入液情況，隨時觀察電極入液、電極接近細胞膜及封接過程電阻變化，串聯(lián)電阻Ra＜20 Mohm的細胞記錄入實驗，用PClamp10.0軟件采集每組6個海馬神經(jīng)元原代細胞的5-HT3受體通道電流數(shù)據(jù)。

2.7 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合要求后再進行參數(shù)檢驗。5-HT3A/3B受體相對表達量及5-HT3受體通道電流密度值數(shù)據(jù)采用單因素方差進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件作圖。計量資料以（）表示，組間比較應用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni's multiple comparisons test，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 舒郁膠囊在大鼠海馬組織中的化學成分鑒定 通過LC-ESI-MSn方法檢測得到舒郁膠囊在大鼠海馬核團和額葉核團各化學成分保留時間和質(zhì)譜信息。（見表1）根據(jù)舒郁膠囊入血成分和代謝產(chǎn)物[9]，通過比對對照品和相關文獻，化合物一級及二級質(zhì)譜信息、保留時間等，對可能通過血腦屏障的化學成分進行分析，確定為進入腦核團的化學成分及其代謝產(chǎn)物。由此共鑒定出舒郁膠囊進入大鼠額葉和海馬中的化學成分有5個，其中4個成分為白芍提取物組共同的化學成分，1個成分為柴胡提取物組共有的化學成分，而下丘腦、紋狀體、小腦、腦干均未檢測到該5種化學成分。

表1 舒郁膠囊給藥后大鼠海馬和額葉中的成分表

化合物1（tR=27.7 min）通過與對照品比對，將其鑒定為芍藥苷。芍藥苷的相對分子質(zhì)量為480，根據(jù)元素組成分析，其分子式應為C23H28O11。在碰撞誘導過程中，準分子離子m/z 479丟失122 Da（苯甲酸基團）生成碎片離子m/z 357，進一步裂解失去一分子甲醛（30 Da）產(chǎn)生碎片離子（m/z 327）。另外，在二級質(zhì)譜圖譜中，準分子離子m/z 479還可以發(fā)生碰撞裂解直接失去一分子的甲醛（30 Da）產(chǎn)生碎片離子（m/z 449）。這些特征離子都提示該化合物結(jié)構(gòu)中應該含有1分子的甲醛和苯甲酸基團?；谝陨戏治?，該化合物可以初步推斷為芍藥苷。芍藥苷可能的ESI-MS/MS裂解途徑見圖1，ESI-MS/MS質(zhì)譜見圖2。

圖1 芍藥苷可能的ESI-MS/MS 裂解途徑

圖2 芍藥苷ESI-MS/MS 質(zhì)譜圖

化合物2（tR=24.6 min）與芍藥苷對照品有相同的溶劑離子峰，其ESI-MS譜產(chǎn)生了[M-H+CH3COO]-離子(m/z 539)，并進一步裂解產(chǎn)生ESI-MS譜m/z 479，繼續(xù)中性丟失122 Da（苯甲酸）、30Da（甲醛）而產(chǎn)生m/z 357、m/z 327和m/z283[M-H-122-30-44]-離子。它們的裂解途徑與芍藥苷類似，ESI-MS/MS質(zhì)譜見圖3。根據(jù)文獻中報道的單萜類成分[11]，此化合物可鑒定為芍藥內(nèi)酯苷。

圖3 芍藥內(nèi)酯苷ESI-MS/MS 質(zhì)譜圖

化合物3（tR＝27.9 min）ESI-MS譜產(chǎn)生了基峰離子m/z 449離子，MS/MS裂解中性丟失122 Da、18 Da等特征裂解途徑，生成碎片離子m/z 327和m/z 309碎片離子，繼而中性丟失162 Da（葡萄糖殘基），形成m/z 165碎片離子。結(jié)合文獻資料[11]，將其鑒定為去羥基去亞甲基芍藥苷。

化合物4（tR＝36.5 min）在ESI-模式下得到m/z 523離子峰，該化合物相對分子質(zhì)量比芍藥苷多44 Da，并且與芍藥苷有共同的碎片離子m/z 479、449，m/z 479([M-H-44]-)離子中性丟失18Da（1分子H2O）得到m/z 461碎片離子，推測該化合物可能是芍藥苷甲酯。這可能是芍藥苷經(jīng)過甲酯化反應后極性變小，易于透過血腦屏障進入大腦組織。

化合物5（tR＝52.1 min）在ESI-模式下得到m/z 455離子峰，根據(jù)前期舒郁膠囊內(nèi)容物化學成分分析及各化學成分在血中移行成分分析結(jié)果[12]，對可能進入腦組織的藥物成分進行研究。柴胡可能的入腦成分是柴胡皂苷元m/z 471，但該成分的提取離子流卻不存在，而存在m/z 455[M-H]-離子。柴胡皂苷元進入腦組織之前必須進行脫氧化物反應。以柴胡皂苷D為例，其準分子離子峰[M-H]-為m/z779（推測元素組成為C42H68O13），在m/z 779發(fā)生裂解失去162 Da（1分子葡萄糖基團）產(chǎn)生m/z 617[M-H-Glc]-碎片離子，然后進一步丟失1分子鼠李糖基團（146 Da）產(chǎn)生柴胡皂苷元m/z 471的碎片離子[M-H-Glc-Rha]-。該碎片離子繼續(xù)發(fā)生脫氧化反應，得到相對分子質(zhì)量比柴胡皂苷元小16 Da。結(jié)合質(zhì)譜碎片信息和對照品裂解規(guī)律，可推測該化合物為柴胡皂苷元脫氧化物，其ESI-MS/MS質(zhì)譜圖見圖4。柴胡皂苷D可能的ESI-MS/MS裂解途徑見圖5。

圖4 柴胡皂苷元脫氧化物ESI-MS/MS 質(zhì)譜圖

圖5 柴胡皂苷D 可能的ESI-MS/MS 裂解途徑

3.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3A/3B受體的蛋白表達各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3A/3BR蛋白表達結(jié)果見圖6～7。與正常組血清所孵育的海馬神經(jīng)元比較，抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）；與抑郁組比較，氟西汀組和舒郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3A受體和5-HT3B受體蛋白表達量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖6 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3A 受體和5-HT3B 受體蛋白表達Western blotting 圖

圖7 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3A 受體和5-HT3B 受體蛋白表達比較（，n=6）

3.3 全細胞膜片鉗電流記錄大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3受體電流 各組大鼠5-HT3R激活電流實驗結(jié)果見圖8。灌流給予5-HT3R激動劑后，各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞可產(chǎn)生一個明顯移動的電流，其電流密度值統(tǒng)計結(jié)果見圖9。與正常組比較，抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞的電流密度值明顯增強（P＜0.05）；與抑郁組比較，氟西汀組和舒郁組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞電流密度值均明顯減弱（P＜0.01）。

圖8 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3R 激活電流反應

圖9 各組大鼠海馬神經(jīng)元原代細胞5-HT3 受體通道電流比較（，n=6）

4 討 論

本研究表明，舒郁膠囊在大鼠腦內(nèi)的吸收成分和代謝產(chǎn)物主要有芍藥苷、芍藥苷甲酯、去羥基去亞甲基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷及柴胡皂苷元脫氧化物，其中白芍提取物對照組大鼠腦內(nèi)均可檢測到前3種成分，柴胡提取物對照組大鼠腦內(nèi)檢測到柴胡皂苷元脫氧化物的存在。舒郁膠囊的君藥是白芍和柴胡，課題組以往數(shù)據(jù)顯示白芍提取物在大鼠腦內(nèi)的吸收成分有芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷[12]。這兩種化學物質(zhì)也是本實驗舒郁膠囊的腦內(nèi)吸收成分。前期研究顯示，舒郁膠囊在血中的吸收成分均含有芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷[10]，結(jié)合本實驗檢測到的大鼠入腦化學成分，可以推測舒郁膠囊被吸收入血后，一部分以原型成分通過血腦屏障進入腦內(nèi)，如芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷；另一部分化學成分則經(jīng)過脫氧化反應轉(zhuǎn)化成小分子（如去羥基去亞甲基芍藥苷、芍藥苷甲酯及柴胡皂苷元脫氧化物）才能透過血腦屏障，以代謝產(chǎn)物的形式進入腦內(nèi)，或者進入腦內(nèi)的芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在腦內(nèi)直接代謝為芍藥苷甲酯和去羥基去亞甲基芍藥苷。這些腦組織內(nèi)的化學成分和代謝產(chǎn)物是舒郁膠囊發(fā)揮抗抑郁作用的物質(zhì)基礎。

5-HT3受體通道屬于非選擇性配體門控陽離子通道，由5個亞基構(gòu)成，每個亞基均由細胞外域，跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[13]。藥物成分或者大鼠體內(nèi)化學成分結(jié)合這些受體的細胞外域部分，可引發(fā)跨膜離子通道的打開和離子（如Na+、K+、Ca2+等陽離子）的流通，從而驅(qū)動5-HT3受體通道電流的形成。本實驗抑郁組血清孵育的海馬神經(jīng)元原代細胞電流密度值明顯增強，可能是因為抑郁組血清異常的化學成分過度結(jié)合了5-HT3AR和5-HT3BR，致使5-HT3AR和5-HT3BR蛋白表達異常升高，也可能是因為抑郁組血清直接影響了Na+、K+、Ca2+離子流通。這與文獻中經(jīng)前期綜合征肝氣郁證模型大鼠血清改變5-HT3受體電流的趨勢相同[10]。同樣，電壓門控離子通道的鈉離子和鉀離子通道部分亞基蛋白表達的異常改變，也會影響神經(jīng)元興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、動作電位和細胞信號轉(zhuǎn)導等[14-16]，從而改變了Na+、K+、Ca2+離子通道的功能。文獻研究表明，經(jīng)前煩燥障礙肝氣逆證模型大鼠情緒調(diào)控腦區(qū)（海馬區(qū)和額葉）5-HT3R蛋白表達減少，恰好反證了本實驗抑郁情緒模型大鼠海馬區(qū)5-HT3R蛋白表達的異常升高。由此推測，抑郁情緒模型大鼠在Na+、K+、Ca2+相關的通道蛋白異常表達等反復刺激中，體內(nèi)化學物質(zhì)不斷改變，促使腦內(nèi)5-HT3A/3BR蛋白表達發(fā)生異常，同時導致5-HT3受體介導的離子通道功能發(fā)生異常。這些異常的5-HT3R反過來又加重抑郁情緒，如此周而復始，共同推進。

5-HT3R離子通道可通過Na+、K+和Ca2+來介導突觸前和突觸后神經(jīng)元的快速去極化反應[18]，進而改變5-HT3R通道的功能。研究表明白芍提取物和柴胡提取物均能通過調(diào)節(jié)5-HT3R通道電流及5-HT3R蛋白表達而發(fā)揮其抗抑郁樣情緒的作用[19-20]。舒郁膠囊以白芍和柴胡共為君藥來發(fā)揮發(fā)揮疏肝解郁、調(diào)暢情志的功效。這些共同佐證了本實驗舒郁膠囊通過下調(diào)5-HT3R蛋白表達和下調(diào)5-HT3R通道電流來拮抗抑郁情緒。研究表明，舒郁膠囊能發(fā)揮5-HT3R拮抗劑作用調(diào)控神經(jīng)元Ca2+內(nèi)流，從而達到神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)平衡[21-22]。可以推測，舒郁膠囊通過拮抗神經(jīng)元細胞外Ca2+內(nèi)流而促使了5-HT3R通道電流密度的降低。有研究顯示芍藥苷可以產(chǎn)生微弱的電壓依賴性Na+和延遲整流K+的抑制[23]，由此可見，舒郁膠囊可能通過本身藥物成分與5-HT3R不同亞基的結(jié)合活性來影響5-HT3R離子通道的功能，也有可能通過改變神經(jīng)元Na+、K+和Ca2+在5-HT3R通道的通透性和流動性來調(diào)節(jié)5-HT3R功能。

本實驗證明，舒郁膠囊經(jīng)大鼠灌胃吸收后，能夠通過血腦屏障，進入大鼠額葉和海馬組織，但是仍舊需要我們繼續(xù)探討舒郁膠囊的化學成分或代謝產(chǎn)物在大鼠腦內(nèi)的作用靶點和富集性問題，以更精準的數(shù)據(jù)研究藥物的作用位點。同時，抑郁組和舒郁組大鼠海馬神經(jīng)元5-HT3R電流的變化，證明了不同狀態(tài)下海馬神經(jīng)元5-HT3R功能的改變。這些離體細胞實驗為將來研究海馬組織的腦片膜片鉗實驗提供了科學依據(jù)，同時在體額葉組織5-HT3受體功能的改變，也有待于用腦片膜片鉗實驗進一步探索。