李 姣，林 潔，易星星，邱冉冉

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）也稱(chēng)為Asherman綜合征，是指子宮內(nèi)膜基底層損傷后，功能層再生修復(fù)障礙及過(guò)度纖維化，正常組織被纖維組織所取代，宮腔部分或完全封閉的一種疾病，清宮術(shù)是導(dǎo)致IUA的主要原因之一[1-2]。由于IUA可導(dǎo)致妊娠早期反復(fù)流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血等不良妊娠結(jié)局，給育齡期女性的生殖生理健康帶來(lái)較大損傷。因此，改善IUA、恢復(fù)子宮功能，是當(dāng)前IUA臨床治療亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題[3]。目前，中醫(yī)藥作為治療IUA的主要手段之一，具有多成分靶點(diǎn)、防治結(jié)合的特點(diǎn)[4]。中醫(yī)臨床治療IUA多以補(bǔ)腎、活血、化瘀為基本治療原則[5-6]。已有多項(xiàng)研究表明，補(bǔ)腎化瘀法治療IUA有顯著療效，能夠促進(jìn)患者子宮內(nèi)膜修復(fù)，降低宮腔再粘連率，改善妊娠結(jié)局，提高生活質(zhì)量，但其作用機(jī)制尚不清楚[7-8]。因此，本研究擬建立大鼠IUA模型，觀察補(bǔ)腎化瘀方對(duì)IUA大鼠子宮內(nèi)膜纖維化的改善作用，探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)SD大鼠75只，健康未孕雌性，體質(zhì)量160～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)條件為室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時(shí)換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，自由采食、飲水，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉處死全部大鼠。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：HNZYYDXDYFSYY20190325。

1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎化瘀方，方藥組成：紫石英15 g，補(bǔ)骨脂8 g，菟絲子8 g，桑寄生8 g，茺蔚子5 g，澤蘭8 g，澤瀉8 g，土鱉蟲(chóng)8 g，三七3 g，覆盆子8 g，蓮子心3 g，甘草3 g，由本院藥劑科制成含有生藥2g/mL的藥液；SRI-011381 hydrochloride（TGF-β通路激活劑）（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：M05956-EKD）；蘇木素染液（批號(hào)：G1080）、伊紅染色液（批號(hào)：G1100）、Masson三色染色試劑盒（批號(hào)：G1340）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R2856c）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0012C）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0896c）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)：K1621）、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（批號(hào)：4309155）均購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）兔單抗（批號(hào)：5154）、Smad3兔單抗（批號(hào)：9523）、Smad4兔單抗（批號(hào)：46535）、p-Smad3兔單抗（批號(hào)：9520）、p-Smad4兔單抗（批號(hào)：38454）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；Smad7免單抗（批號(hào)：ab264745）、p-Smad7兔單抗（批號(hào)：ab272928）均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（IgG-HRP）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：A0208）。

1.3 主要儀器 DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；IX53型顯微鏡（日本奧林巴斯）；G:BOX型多功能凝膠成像系統(tǒng)（Syngene）；7500型PCR儀（美國(guó)Applied biosystems）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）。

1.4 造模與分組 參考文獻(xiàn)[9]方法建立大鼠IUA模型：大鼠腹腔注射5%的水合氯醛溶液麻醉，無(wú)菌條件下于大鼠下腹正中部位縱切一長(zhǎng)3～4 cm的切口，分離組織，暴露子宮。在距宮體交界處1 cm的左宮角橫切開(kāi)一微小切口，用自制的小刮勺向?qū)m角遠(yuǎn)端搔刮左側(cè)子宮腔4圈，搔刮長(zhǎng)度約4 cm，待宮腔四壁有粗糙感時(shí)，停止搔刮。于宮腔內(nèi)留置已備好的脂多糖棉線，同法處理右側(cè)子宮角。生理鹽水沖洗腹腔，縫合切口，留置約2 cm的棉線殘端于腹部，48 h后輕拉尾絲，取出宮內(nèi)棉線。另取15只大鼠作為假手術(shù)組，僅在大鼠宮頸上方做一切口，不刮宮，生理鹽水沖洗腹腔后縫合。將建立IUA模型的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、補(bǔ)腎化瘀方組、補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組、SRI-011381組，每組15只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 按照前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及人與大鼠體表面積折算等效劑量，補(bǔ)腎化瘀方組、補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組大鼠灌胃給予補(bǔ)腎化瘀方藥液，8.9 g/kg，同時(shí)，補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組、SRI-011381組大鼠腹腔注射SRI-011381，10 mg/kg，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)21 d。

1.6 觀察指標(biāo) 末次給藥后24 h，各組大鼠腹腔注射5%的水合氯醛溶液麻醉，腹主動(dòng)脈取血，置于4 ℃冰箱中靜置3 h，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，分裝后凍存于-80 ℃冰箱中，用于ELISA試劑盒檢測(cè)。分離各組大鼠子宮組織，觀察形態(tài)，取右側(cè)子宮組織于4%多聚甲醛中固定，用于HE和Masson染色，其余組織凍存于-80 ℃冰箱中，用于RT-qPCR及Western blotting檢測(cè)。

1.6.1 大鼠子宮組織病理變化 將大鼠子宮組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，作4 μm組織切片，二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇及蒸餾水中復(fù)水，HE染色，脫水、透明后中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察大鼠異位灶組織病理變化，在每張HE染色切片中隨機(jī)選取4個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算每個(gè)視野的腺體數(shù)量并求平均值。

1.6.2 大鼠子宮組織纖維化情況 大鼠子宮組織固定、病理切片制作、脫蠟和復(fù)水過(guò)程同“1.6.1”。按照Masson染色試劑盒的操作步驟進(jìn)行染色，光鏡下觀察子宮組織纖維化情況，在每張Masson染色切片中隨機(jī)選取4個(gè)高倍鏡視野，使用Image J軟件計(jì)算子宮內(nèi)膜間質(zhì)膠原纖維部分的面積與子宮內(nèi)膜間質(zhì)總面積之比，并求平均值。

1.6.3 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 取各組大鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.4 子宮內(nèi)膜TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA和Smad7 mRNA表達(dá)水平 取子宮組織，研磨勻漿后加入Trizol裂解液提取總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃5 min終止反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6.5 TGF-β1/Smad通路蛋白表達(dá)水平 取子宮組織，研磨勻漿后加入裂解液提取組織蛋白，測(cè)定蛋白濃度，蛋白中加入loading buffer煮沸使之變性，按照30 μg/孔的上樣量進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，放入各一抗稀釋液（1∶1 000）中4 ℃孵育過(guò)夜，次日以TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000）37 ℃孵育2 h，洗膜，滴加發(fā)光液，置凝膠成像儀中顯影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件分析各蛋白對(duì)應(yīng)的灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)觀察 假手術(shù)組大鼠子宮組織的表面呈淡粉色，延展性良好，形態(tài)勻稱(chēng)；模型組大鼠子宮組織明顯增粗，有充血現(xiàn)象，延展性較差；與模型組比較，補(bǔ)腎化瘀方組大鼠子宮的增粗現(xiàn)象有所減輕，粗細(xì)均勻，延展性尚可；補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組和SRI-011381組大鼠子宮組織仍有明顯增粗和充血，彈性減退。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)

2.2 各組大鼠子宮組織病理學(xué)變化比較 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠子宮組織形態(tài)規(guī)則，可見(jiàn)清晰的內(nèi)膜層、漿膜層和肌層，黏膜下層可見(jiàn)較多的腺體，排列整齊，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠子宮組織內(nèi)膜層被破壞，結(jié)構(gòu)疏松，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎化瘀方組大鼠子宮內(nèi)膜增厚，腺體數(shù)量增加，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，而SRI-011381可削弱補(bǔ)腎化瘀方的作用，使大鼠的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加（P＜0.05）。Masson染色顯示，假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)組織僅可見(jiàn)少量藍(lán)色膠原纖維；模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織可見(jiàn)大量的膠原纖維生成，排列緊密，纖維化面積明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，補(bǔ)腎化瘀方組大鼠子宮內(nèi)膜組織膠原纖維的生成減少，分布相對(duì)稀疏，纖維化面積減少（P＜0.05），而SRI-011381可削弱補(bǔ)腎化瘀方的作用，補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組和SRI-011381組大鼠子宮內(nèi)膜的纖維化面積均高于補(bǔ)腎化瘀方組（P＜0.05）。（見(jiàn)圖2～3）

圖2 各組大鼠子宮組織病理學(xué)變化（×400）

圖3 各組大鼠子宮組織腺體數(shù)量及纖維化面積比較（，n=15）

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎化瘀方組、補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381 組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低（P＜0.05），SRI-011381組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高（P＜0.05），其中補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于補(bǔ)腎化瘀方組（P＜0.05）。（見(jiàn)圖4）

圖4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比較（，n=15）

2.4 各組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA和Smad7 mRNA表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎化瘀方組和補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05），Smad7 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05），Smad7 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），其中補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達(dá)均高于補(bǔ)腎化瘀方組（P＜0.05），Smad7 mRNA表達(dá)低于補(bǔ)腎化瘀方組（P＜0.05）。（見(jiàn)圖5）

圖5 各組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA 和Smad7 mRNA 表達(dá)水平比較（，n=15）

2.5 各組大鼠子宮組織TGF-β1/Smad通路蛋白表達(dá)水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎化瘀方組和補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均降低（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平均升高（P＜0.05），SRI-011381 組大鼠子宮組織TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化均升高（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化表達(dá)降低（P＜0.05），其中補(bǔ)腎化瘀方+SRI-011381組大鼠子宮組織TGFβ1、Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平均高于補(bǔ)腎化瘀方組（P＜0.05），Smad7蛋白磷酸化水平低于補(bǔ)腎化瘀方組（P＜0.05）。（見(jiàn)圖6～7）

圖6 各組大鼠子宮組織TGF-β1/Smad 通路蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖7 各組大鼠子宮組織TGF-β1/Smad 通路蛋白表達(dá)水平比較（，n=15）

3 討 論

近年來(lái)，IUA的發(fā)病率和檢出率逐年升高，患者發(fā)病年齡亦呈年輕化趨勢(shì)[10]。IUA具有子宮內(nèi)膜纖維化的病理特征，而子宮內(nèi)膜纖維化也是IUA的發(fā)病機(jī)制之一，防止宮腔黏膜過(guò)度纖維化具有重要意義[11-12]。IUA屬中醫(yī)“閉經(jīng)”“斷緒”“無(wú)子范疇”，先天腎氣不足、房勞多產(chǎn)、宮腔手術(shù)等均可致腎虛，同時(shí)宮腔手術(shù)可導(dǎo)致子宮受損，瘀血內(nèi)停，邪氣趁虛而入，氣血運(yùn)行不暢，因而導(dǎo)致患者經(jīng)血不通、閉經(jīng)、不孕，治療當(dāng)以補(bǔ)腎、活血、化瘀為基本治療原則[13-14]。補(bǔ)腎化瘀方中紫英石、補(bǔ)骨脂為君藥，補(bǔ)腎助陽(yáng)；菟絲子補(bǔ)益肝腎，潤(rùn)燥補(bǔ)虛；桑寄生補(bǔ)肝腎，安胎元；覆盆子填精補(bǔ)髓，疏利腎氣；蓮子心交通心腎，可制君藥的溫燥；澤蘭、澤瀉、茺蔚子和三七調(diào)經(jīng)活血；土鱉蟲(chóng)破血逐瘀；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏補(bǔ)腎填精、活血化瘀之功效。

本研究建立了IUA大鼠模型，模型組大鼠子宮組織明顯增粗，內(nèi)膜層破壞，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體數(shù)量明顯減少，纖維化面積明顯增加，表明造模成功。使用補(bǔ)腎化瘀方治療后，IUA大鼠子宮組織形態(tài)趨于正常，腺體數(shù)量增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化程度減輕，表明補(bǔ)腎化瘀方對(duì)IUA子宮內(nèi)膜病理學(xué)改變具有改善作用。TNF-α、IL-1β、IL-6均是參與機(jī)體免疫應(yīng)答、具有廣泛免疫調(diào)節(jié)的促炎性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)異位內(nèi)膜及間質(zhì)細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，以及促進(jìn)血管生成的作用，能增加盆腔局部組織粘連及纖維化的發(fā)生率[15-16]。在本研究中，模型組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，使用補(bǔ)腎化瘀方治療后，IUA大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，表明補(bǔ)腎化瘀方可減輕大鼠IUA的炎癥反應(yīng)。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的水平升高常在發(fā)生不受控制的纖維化反應(yīng)的組織中出現(xiàn)，TGF-β1的表達(dá)水平亦與子宮內(nèi)膜纖維化程度呈正相關(guān)[17]。Smad是參與TGF-β信號(hào)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的一個(gè)蛋白家族，TGF-β1/Smad通路的失調(diào)可導(dǎo)致機(jī)體組織纖維化，Smad3和Smad4是TGF-β1的關(guān)鍵下游信號(hào)分子，Smad7為Smad家族的抑制性蛋白，活化的TGF-β1與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后可催化Smad3和Smad4磷酸化，使Smad3與Smad4結(jié)合后入核，進(jìn)一步調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[18-19]。在本研究中，模型組大鼠子宮組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達(dá)和Smad3、Smad4蛋白磷酸化水平明顯升高，Smad7 mRNA表達(dá)和Smad7蛋白磷酸化水平明顯降低，使用補(bǔ)腎化瘀方治療后，IUA大鼠的TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、Smad4 mRNA表達(dá)和Smad3、Smad4蛋白磷酸化減少，Smad7 mRNA表達(dá)和Smad7蛋白磷酸化增加，表明補(bǔ)腎化瘀方可抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活。為了進(jìn)一步探究補(bǔ)腎化瘀方對(duì)TGF-β1/Smad通路的調(diào)控作用，本研究使用了TGF-β通路激活劑SRI-011381，結(jié)果顯示，SRI-011381明顯削弱了補(bǔ)腎化瘀方對(duì)IUA大鼠子宮內(nèi)膜纖維化的抑制作用，并進(jìn)一步加重了纖維化病變和炎癥反應(yīng)，提示補(bǔ)腎化瘀方對(duì)IUA的治療作用可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路產(chǎn)生的。

綜上所述，補(bǔ)腎化瘀方可能通過(guò)影響TGF-β1/Smad通路的活化改善IUA相關(guān)子宮內(nèi)膜纖維化，初步揭示了補(bǔ)腎化瘀方治療IUA的作用機(jī)制，但I(xiàn)UA是一種多因素疾病，病機(jī)復(fù)雜，補(bǔ)腎化瘀方治療IUA的療效及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)及臨床研究加以闡明。