朱慧淵，王文蠧，羅 斌，苗 琦，董炳耀

（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710068）

腦血管疾病是當今世界威脅人類健康與生存的重大疾病之一，其中又以腦缺血較為多見。腦缺血主要是由于血管栓塞造成腦血流量減少、腦組織血氧供應不足以致?lián)p傷[1]，后期產生腦細胞能量代謝障礙、炎癥反應、興奮性氨基酸毒性作用、氧化應激、細胞凋亡[2]、細胞自噬等一系列病理過程，最終導致神經功能障礙[3-4]。

研究[5]表明，腦缺血發(fā)生后，大腦不同缺血區(qū)域的神經細胞出現(xiàn)不同的變化，中心部分細胞壞死，半暗帶區(qū)域則出現(xiàn)凋亡。細胞壞死具有不可逆性，只能通過調控半暗帶缺血區(qū)相關細胞凋亡信號通路以減輕缺血性腦損傷。目前熱點研究的細胞凋亡通路有Notch信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、Janus激酶－信號轉導和轉錄激活子（JAK/STAT）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Fas/FasL信號通路和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）信號通路。這些細胞凋亡通路與細胞的生長及死亡有緊密聯(lián)系。

中醫(yī)益氣活血法干預腦缺血研究呈現(xiàn)一種良好的發(fā)展趨勢，涵蓋了中醫(yī)治療的多個領域，包括辨證施治、傳統(tǒng)古方[6]、經驗方[7]、中藥有效成分提取物[8]等，體現(xiàn)出益氣活血法應用在防治腦缺血方面的優(yōu)勢。本文綜述了近年來益氣活血法干預腦缺血神經細胞凋亡的作用及機制研究進展。

1 中醫(yī)學對腦缺血的認識

腦缺血歸屬于中醫(yī)學“中風”的范疇，其病因病機涉及多種因素，包括氣、血、風、痰、虛、火6種致病因素。在氣血虧虛的基礎上，受到飲食不節(jié)、內傷勞倦、情志所傷等影響，引起陰陽平衡失調、氣血上逆入腦，最終導致腦脈閉阻不通[9]。

《黃帝內經》時期的“內虛邪中”學說認為本病的發(fā)病因素是因虛外感風邪所致。金元時期，朱丹溪提出“痰熱生風”的思想，成為“內風”學說的早期萌芽。明清時期，葉天士提出“肝陽化風”的學說；王清任在此基礎上，提出“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，認為“氣虛血瘀”為中風病的關鍵致病因素，也貫穿整個疾病發(fā)展的各個時期?；谝陨蠈W術思想，眾多醫(yī)家提出不同的治療大法，其中益氣活血法是預防中風的重要原則，也是治療中風的基本思路[9]。

氣血互為根本，互為影響。氣能生血，氣能行血。血脈瘀滯，血行不暢，亦可阻礙氣機的運行。因此，益氣為新血生化之源，為治本之要；活血使新血再生，為治標之本[10]。臨床治療和實驗研究也進一步證實，中醫(yī)藥治療中風療效確切[11]。研究表明，益氣活血方藥具有抗細胞凋亡、促進血管新生、抗缺血損傷等效應[12-13]。

2 益氣活血法干預腦缺血細胞凋亡信號通路的作用機制

氣虛血瘀是腦缺血的重要病機之一，故益氣活血法為臨床治療腦缺血的主要治則之一[14]。益氣活血法干預腦缺血可通過抗神經細胞凋亡、促神經再生、改善能量代謝，以達到抗缺血后腦損傷的保護作用。臨床研究表明，益氣活血方藥可達到攻補兼施、益氣活血、祛瘀通絡的功效，從而改善腦缺血患者的生活質量，提高臨床療效[15]。目前針對益氣活血法干預腦神經細胞凋亡的通路研究主要包括Notch 信號通路、PI3K/Akt信號通路、JAK-STAT信號通路、MAPK信號通路、Fas/FasL信號通路、Caspase信號通路。

2.1 Notch信號通路 Notch信號通路的發(fā)現(xiàn)與果蠅體內突變相關，它與腦缺血后神經生長、發(fā)育密切相關，屬于一條高度保守的信號通路。Notch信號通路主要由Notch受體、Notch配體、胞內效應分子等組成[16]。在缺血狀態(tài)下，Notch信號通路可調控細胞凋亡、免疫炎癥損傷、突觸可塑性及神經發(fā)生等多個方面，且Notch信號通路在缺血再灌注的腦組織中，啟動參與了腦缺血后的病理改變及功能恢復[17-18]。張滕飛[19]研究發(fā)現(xiàn)中風膏（古方“佛手散”為基礎化裁）可促進腦缺血大鼠的神經功能修復，升高Notch1基因、神經生長因子（NGF）的陽性表達，其機制可能是調控Notch信號通路。研究[20]發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈阻塞模型（MCAO）大鼠腦組織Notch1、Hes1及Hes5表達顯著升高，補陽還五湯干預14 d后，MCAO大鼠Notch1、Hes1及Hes5表達顯著增加，腦組織細胞與神經功能表達改善，提示Notch信號通路被激活對腦缺血再灌注損傷（CIRI）有保護作用，可通過調節(jié)下游效應分子Hes1、Hes5，達到調控神經干細胞（NSCs）的增殖和分化。參芎化瘀膠囊可提高缺血性腦卒中大鼠Notch1、血管內皮生長因子（VEGF）陽性蛋白的表達，進而改善神經細胞的形態(tài)和功能，并提高大鼠存活率[21]。研究[22]顯示腦泰方（黃芪、川芎、地龍等）能夠促進MCAO大鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI）神經細胞再生，提高大鼠海馬Nestin、Notch1陽性細胞表達，腦泰方可能通過調控Notch信號通路發(fā)揮保護腦細胞的作用。

2.2 PI3K/Akt信號通路 PI3K/Akt信號通路是調控細胞存活、生長和增殖的重要信號通路，在正常細胞中的表達量很少。當正常細胞受到刺激時，PI3K/Akt信號相關因子則被釋放出來大量表達。激活后的PI3K迅速使細胞膜上的肌醇磷酸化，從而激活Akt。Akt被激活后繼續(xù)激活其下游的信號因子，從而起到抗細胞凋亡的作用[23]。Akt亦稱為蛋白激酶B，能直接磷酸化多重轉錄因子，并通過調控轉錄因子降低凋亡基因的表達，提高抗凋亡基因的表達，達到恢復細胞功能。

PI3K/Akt信號通路激活后，通過誘導血管內皮生長因子（VEGF）的表達進而促使血管再生，而此信號通路被抑制后，VEGF的表達明顯降低，這提示PI3K/Akt信號通路激活后能夠通過增強VEGF的表達發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。研究[24]證實，抑制PI3K和Akt的磷酸化，阻斷PI3K/Akt途徑可抑制血管新生。

研究[25]表明，腦缺血后小鼠PI3K、Akt蛋白，以及PI3K mRNA、Akt mRNA表達均上升。補陽還五湯能改善腦缺血后小鼠神經功能，調控相關蛋白，進而發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。通心絡在心腦血管疾病的治療中應用范圍廣。研究[26]顯示，通心絡可通過激活PI3K/Akt通路，保護MCAO大鼠神經，明顯減小腦梗死范圍，降低神經細胞凋亡，改善神經功能。PDK1蛋白也是促使PI3K/Akt通路激活的重要蛋白分子，補陽還五湯能降低急性腦缺血再灌注大鼠血小板PDK1蛋白磷酸化水平，通過抑制PI3/Akt信號通路的激活，降低血小板活化程度，減少腦梗死面積，發(fā)揮抗腦損傷的作用。

2.3 JAK-STAT信號通路 JAK/STAT信號通路通過細胞因子刺激而發(fā)揮信號轉導作用，主要參與細胞生長、分裂及凋亡等過程[28]。JAK-STAT通路由3個成分構成，即酪氨酸激酶相關受體、酪氨酸激酶JAK及轉錄因子STAT。JAK屬于非跨膜型的酪氨酸激酶，其蛋白家族共包括4個成員：JAK1、JAK12、JAK3及Tyk2。JAK蛋白家族既能磷酸化與其相結合的細胞因子受體，又能磷酸化多個具有特定結構域的信號分子。STAT被稱為“信號轉導子和轉錄激活子”，目前已發(fā)現(xiàn)它有6個家族成員，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6。

腦絡欣通方為新安醫(yī)學益氣活血法的代表中醫(yī)復方，研究[29]發(fā)現(xiàn)，腦絡欣通（黃芪30 g，三七3 g，川芎6 g，紅花10 g，當歸10 g，天麻10 g，蜈蚣2條）可通過JAK-STAT信號轉導通路調節(jié)腦缺血再灌注（MCAO-R）大鼠模型NSCs增殖、分化。益氣活血法效驗方腦絡欣通可能通過JAK-STAT信號轉導通路，促進海馬NSCs的遷移。腦心通臨床多應用于氣虛血滯、脈絡瘀阻所致中風的治療。研究[30]顯示，CIRI大鼠腦組織中JAK2、STAT3表達增加。腦心通能降低CIRI大鼠腦組織JAK2、STAT3陽性表達，減少腦梗死體積，降低細胞凋亡數量，提示腦心通在一定程度上抑制了JAK2、STAT3信號通路，從而抑制神經細胞凋亡，修復腦神經功能，最終發(fā)揮保護腦組織的作用。

2.4 MAPK信號通路 MAPK屬于絲蛋白/蘇氨酸激酶家族。MAPK相關信號通路已被證實在細胞的生長分化、促使細胞凋亡損傷進程中具有明顯作用。腦組織缺血缺氧產生后，中樞神經系統(tǒng)中的MAPK信號轉導途徑被誘導刺激活化，這一系列變化對神經元的生存與凋亡產生了關鍵的調控作用[31]。研究[32]顯示，在眾多亞族組成的MAPK通路中，大多數實驗研究及臨床研究探討了p38MAPK、細胞外信號調節(jié)激酶（ERK-1/2）和c-Jun末端激酶（JNK）3個途徑。p38MAPK通路是MAPK通路的重要組成通路之一，主要參與調控細胞核相關基因表達的轉錄，同時誘導細胞炎癥反應、侵襲、凋亡、分化等重要生理過程的進行[33]。

此外，CIRI大鼠的海馬神經細胞凋亡機制相關實驗研究結果提示，與模型組比較，參芎化瘀膠囊組大鼠海馬神經細胞凋亡數量明顯下降，且p38MAPK陽性細胞數低于模型組；其機制與抑制p38MAPK信號轉導通路激活，從而抑制神經細胞凋亡有關[34]。研究[35]顯示，補陽還五湯具有保護神經及促進神經功能修復的作用，補陽還五湯能通過上調腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）的陽性表達,激活MAPK/ERK信號通路,通過信號轉導級聯(lián)中的關鍵分子誘導神經細胞結構再塑，發(fā)揮抗神經細胞凋亡的作用。

2.5 Fas/FasL信號通路 Fas作為凋亡信號基因，其產物Fas蛋白是凋亡信號的受體。Fas配體（FasL）屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族中的一種。

Fas蛋白通過介導死亡受體通路，在細胞凋亡中具有傳遞信號的功能。Fas蛋白作為凋亡信號的受體，可與FasL結合，兩者均屬于TNF超家族；FasL又稱CD95L、APO-1L，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量為40 kD，是TNF超家族成員。FasL最經典的功能為誘導細胞凋亡。FasL與靶細胞表面受體Fas結合后，F(xiàn)as胞內死亡結構域（death domain，DD）形態(tài)發(fā)生變化，聚集Fas相關死亡結構域（Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）與之結合，F(xiàn)ADD又可結合細胞質內的Caspase-8，F(xiàn)as-FADD-Caspase-8組合成死亡誘導信號復合物（death-inducing signaling complex，DISC），誘導Caspase-8激活，活化的Caspase-8再進一步激活下游Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7從而導致細胞凋亡[36]。

Fas/FasL信號通路在細胞凋亡中發(fā)揮了不可或缺的作用，F(xiàn)as與FasL相結合后觸發(fā)信號通路下游一系列凋亡基因的級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。腦缺血發(fā)生后Fas、FasL蛋白表達明顯增高，提示其是CIRI發(fā)病機制之一[37]。CIRI可以促進Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白的陽性表達，進而激活它們所在的信號通路引起神經元凋亡。腦缺血預處理可使Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白的表達水平下降，從而減少神經元的凋亡數量。因此，抑制Fas/FasL通路的激活可能是抗缺血性腦損傷的機制之一[38]。

研究[39]表明，參芎通脈顆粒預處理及治療均能一定程度緩解腦缺血再灌注大鼠模型的神經損傷；與模型組比較，預處理組及治療組Fas的表達降低（P＜0.05）。參芎通脈顆粒預處理和治療均能抑制MCAO大鼠神經細胞的凋亡。腦健膠囊、康腦液均為臨床經驗方，由補陽還五湯化裁而來，由黃芪、丹參、川芎、鉤藤、三七粉等組成，具有益氣活血化瘀、清熱平肝、息風定驚的作用。研究[40]顯示，康腦液各劑量組能減少腦缺血大鼠梗死灶周邊細胞Fas和Caspase-3表達，阻斷細胞凋亡相關級聯(lián)反應，促進神經元功能修復。

2.6 Caspase信號通路 Caspase家族分子具有很高的同源性，至今共發(fā)現(xiàn)14個家族成員，按發(fā)現(xiàn)的時間順序依次命名為Caspase-1至Caspase-14。細胞凋亡的發(fā)生機制復雜，Caspase酶主要通過線粒體/Cytc通路、死亡受體通路和內質網通路3種形式完成。短暫MCAO后，Caspase相關活化過程持續(xù)達9 h，抑制Caspase后可以減少損傷。抑制Caspase為中風有效臨床治療時間窗的依據[41]。研究[42]發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能夠明顯降低腦缺血再灌注大鼠腦細胞凋亡百分比，并上調Bcl-2的陽性表達，下調Bax的陽性表達，降低Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白活性；提示補陽還五湯可以通過影響細胞凋亡相關蛋白的陽性表達，進而抑制神經細胞凋亡。此外，紅景天苷可通過激活PI3K/Akt信號轉導通路，上調PI3K、p-Akt的蛋白表達，抑制Caspase-3的蛋白表達，從而發(fā)揮對大鼠腦缺血-再灌注損傷抗凋亡的神經保護作用[43]。

3 總結與展望

腦缺血可以激活多條信號通路，這些信號通路之間存在著廣泛的相互作用，其中由于大腦缺血缺氧引發(fā)的神經細胞凋亡在近幾年的研究中備受矚目。目前已有實驗結果驗證，中醫(yī)復方防治中風具有明顯的優(yōu)勢，可同時對神經細胞凋亡過程中相關多個環(huán)節(jié)多個方面進行有效調控，通過調節(jié)多條通路上下游靶點蛋白的表達，出現(xiàn)相應的生物學效應，進而降低腦缺血后神經元凋亡的數量，緩解缺血后腦組織損傷的嚴重程度。通過對這些信號通路的研究，我們亦發(fā)現(xiàn)這些通路是非單一的，而是一個復雜的瀑布式級聯(lián)反應，并且在同一條通路中，也同時存在著促凋亡和抗凋亡兩種不同的效應。但益氣活血法的治療機制非常繁雜，要闡明其具體機制需要我們后續(xù)不斷研究和深入探討。因此，我們后續(xù)將開展凋亡調控因子及其信號通路相關作用機制的系統(tǒng)研究，進一步探索神經元損傷的作用靶點和作用機制，為臨床應用提供理論依據。