于 倩，安喆妮

（湖南省兒童醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

細(xì)菌性腦膜炎（bacterial meningitis，BM）多發(fā)于新生兒期，是由不同病原菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病[1]。B族溶血性鏈球菌（group B hemolytic strepto coccus，GBS）是引起新生兒腦水腫、血腦屏障損傷、神經(jīng)系統(tǒng)損傷及死亡的主要致病菌[2]。RAS同源基因家族成員A（RAS homologous gene family member A，RhoA）/Rho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶2（Rhorelated spiral coiled protein kinase 2，ROCK2）通路可抑制神經(jīng)元內(nèi)信號轉(zhuǎn)入、收斂細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)、抑制軸突生長，從而參與神經(jīng)元突起的延長和再生過程[3]，且抑制RhoA/ROCK2通路對神經(jīng)有保護(hù)作用[4]。但RhoA/ROCK2通路在BM神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的調(diào)控作用，還未見報道。黃芪甲苷是中藥黃芪中的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能顯著抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷，并能夠通過調(diào)控mTOR、炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體自噬等多種途徑，來抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元再生及修復(fù)，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。但黃芪甲苷是否對BM引起的神經(jīng)損傷有保護(hù)作用，還未見報道。本研究擬建立大鼠BM模型，對此進(jìn)行驗證，并探究其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用是否與RhoA/ROCK途徑有關(guān)，以期為黃芪甲苷的開發(fā)應(yīng)用及BM的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 3周齡健康SPF級SD新生大鼠100只，體質(zhì)量約50 g，雌雄不限，購自福州海王福藥制藥有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（閩）2020-0001，動物使用許可證號：SYXK（閩）2020-0006。所有大鼠于本院動物房中常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：室溫（23±2）℃，濕度（55±10）%，自然光照。本實驗經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，符合3R原則。

1.2 藥物與試劑 黃芪甲苷鈉標(biāo)準(zhǔn)品（上海寶曼生物科技有限公司，批號：20190413）；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：20190303）；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）ELISA試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：20190403）；降鈣素原（PCT）ELISA試劑盒（上海撫生實業(yè)有限公司，批號：20190523）；兔抗大鼠RhoA抗體（美國abcam公司，貨號：ab187027）；ROCK抗體（美國abcam公司，貨號：ab134181）；勿動蛋白-A（Nogo-A）抗體（美國abcam公司，貨號：ab62024）；溶血磷脂酸（LPA）抗體（美國abcam公司，貨號：ab23698）；雞抗大鼠微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體（美國abcam公司，貨號：ab5392）；TUNEL染色試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司，批號：20190304）；鬼筆環(huán)肽染色液（廣州宏新生物技術(shù)有限公司，批號：20190416）。

1.3 主要儀器 SMZ745型光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；GIS-500型化學(xué)發(fā)光成像儀（杭州米歐公司號）；ASA-602S腦立體定向儀（深圳安科高技術(shù)股份有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell蛋白電泳儀（美國伯樂公司）；M-Blot快速轉(zhuǎn)膜儀（南京中科通儀科技有限公司）；JEM-F200透射電鏡儀器（日本電子株式會社）。

1.4 造模與分組 取SD新生大鼠80只，參照文獻(xiàn)[6]方法制備GBS菌液，將大鼠麻醉后，用腦立體定向儀向大鼠小腦延髓池注入濃度為1×108cfu/L的GBS菌液50 μL，建立BM模型。感染后24 h，抽取腦脊液并檢測腦脊液中TNF-α水平，若TNF-α水平高于正常腦脊液10倍以上，視為造模成功。共80只大鼠造模成功，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、黃芪甲苷組、RhoA激動劑組、黃芪甲苷+RhoA激動劑組，每組20只。另取20只大鼠，于腦側(cè)室相同部位注入等量生理鹽水，作為正常對照組。

1.5 實驗給藥 參照文獻(xiàn)[7]將黃芪甲苷用生理鹽水稀釋成濃度為4.00 mg/mL的混懸液，黃芪甲苷組大鼠按10 mL/kg的劑量經(jīng)腹腔注射給藥3 d，2次/d；RhoA激動劑參照文獻(xiàn)[8]設(shè)置劑量，RhoA激動劑組大鼠用微量注射器于小腦延髓池注入濃度為50 μmoL/L的RhoA激動劑溶液（按1 mL/kg劑量，每只大鼠約50 μL）1次；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腹腔注射黃芪甲苷溶液的同時經(jīng)小腦延髓池注射RhoA激動劑溶液；模型組及正常對照組大鼠經(jīng)腹腔注射及經(jīng)小腦延髓池注射等量生理鹽水。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠一般行為觀察 給藥期間觀察各組大鼠毛色、行為活動及死亡狀況。

1.6.2 大鼠腦脊液中TNF-α、NSE及PCT水平 0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用腦立體定向儀，從小腦延髓池穿刺進(jìn)針后回抽腦脊液50 μL，取1 mL腦脊液，按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、NSE及PCT水平。

1.6.3 大鼠腦皮質(zhì)組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 將大鼠用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，采用尾靜脈空氣栓塞法處死，開顱取腦，冰上分離腦皮質(zhì)組織，剪取1 mm3腦皮質(zhì)組織，用4%戊二醛固定后，送于電鏡室處理后，電鏡下觀察腦皮質(zhì)組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化。剩余腦皮質(zhì)組織分成兩部分，一部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，另一部分置?%多聚甲醛中固定備用。

1.6.4 大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率 取“1.6.3”項下4%多聚甲醛中固定的腦皮質(zhì)組織，常規(guī)透明、浸蠟、包埋后，切成5 μm的間斷連續(xù)切片。取部分切片，按TUNEL染色試劑盒說明書方法進(jìn)行染色后，置于顯微鏡下觀察神經(jīng)元染色情況，凋亡細(xì)胞被染為紅棕色，用Image J圖像分析軟件統(tǒng)計檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6.5 F-actin在神經(jīng)元細(xì)胞中分布情況 取“1.6.4”項下部分切片石蠟切片，脫蠟及抗原修復(fù)后，加入曲拉通（Triton）透化30 min，滴加IgG標(biāo)記的MAP2（1∶200）抗體，室溫孵育過夜后，滴加相應(yīng)二抗溶液，室溫避光孵育1 h后，加入2 mg/mL FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽溶液室溫避光染色3 h后，用抗熒光淬滅劑封片，熒光共聚焦顯微鏡觀察腦皮層神經(jīng)元中F-actin分布情況。

1.6.6 MAP2與RhoA共表達(dá)水平 取“1.6.4”項下部分切片，脫蠟及抗原修復(fù)后，加入曲拉通（Triton）透化1 h，加入一抗（MAP2、RhoA，1∶200），4 ℃孵育過夜后，加入二抗[羊抗兔-FITC（綠）和山羊抗雞IgG（紅）]室溫避光孵育2 h，DAPI顯色，封片，用熒光顯微鏡觀察并拍照，并通過Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)測定陽性染色細(xì)胞數(shù)目。

1.6.7 大鼠腦皮質(zhì)組織ROCK2陽性表達(dá)水平 取“1.6.4”項下部分切片石蠟切片，于37 ℃條件脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，加入一抗（ROCK2，1∶500），4 ℃孵育過夜后，加入羊抗兔二抗（1∶1 000），4 ℃孵育3 h，后進(jìn)行DAB顯色及蘇木精溶液復(fù)染、透明、封片，于光鏡下觀察拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)棕褐色區(qū)域積分光密度值。

1.6.8 大鼠腦皮質(zhì)組織Nogo-A、LPA蛋白相對表達(dá)水平 取“1.6.4”中-80 ℃保存的腦皮質(zhì)組織，4 ℃解凍后，冰上勻漿分離提取蛋白，用BCA法檢測蛋白總濃度。取50 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，并加入一抗（Nogo-A、LPA，1∶800，內(nèi)參β-actin，1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入HRP羊抗兔二抗（1∶3 000）室溫孵育2 h，用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，以化學(xué)發(fā)光成像儀觀察條帶并拍照，以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，單因素方差分析行多組間比較，SNK-q檢驗行進(jìn)一步組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般行為觀察 正常對照組大鼠無死亡，飲食及活動正常；模型組和黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠有4只死亡，活動量減少；黃芪甲苷組大鼠無死亡，活動量稍有增加；RhoA激動劑組大鼠有8只死亡，活動量進(jìn)一步減少。

2.2 各組大鼠腦脊液中TNF-α、NSE、PCT水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠腦脊液中TNF-α、NSE、PCT水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腦脊液中TNF-α、NSE、PCT水平明顯降低（P＜0.05），RhoA激動劑組大鼠腦脊液中TNF-α、NSE、PCT水平明顯升高（P＜0.05）；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腦脊液中NSE、PCT水平明顯高于黃芪甲苷組（P＜0.05）；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腦脊液中NSE、PCT水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠腦脊液中TNF-α、NSE、PCT 水平比較（）

表1 各組大鼠腦脊液中TNF-α、NSE、PCT 水平比較（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化比較 正常對照組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常；模型組及黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，可見線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等細(xì)胞器壞死現(xiàn)象；黃芪甲苷組大鼠神經(jīng)元較為規(guī)整，且細(xì)胞器壞死減少；RhoA激動劑組大鼠神經(jīng)元損傷及細(xì)胞器變形壞死進(jìn)一步加重。（見圖1）

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)圖（×15 000）

2.4 各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較 模型組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組（P＜0.05）；黃芪甲苷組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.05）；RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組和黃芪甲苷組（P＜0.05）；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯高于黃芪甲苷組（P＜0.05）；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖2、表2）

圖2 大鼠腦皮質(zhì)組織TUNEL 染色圖（×400）

表2 各組大鼠腦皮質(zhì)組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較（，%）

表2 各組大鼠腦皮質(zhì)組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較（，%）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷組比較，cP＜0.05

2.5 黃芪甲苷對大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞骨架重排的影響 F-actin為細(xì)胞骨架重排的標(biāo)志分子，熒光染色顯示：正常對照組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞胞漿中F-actin熒光表達(dá)較弱；模型組和黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠F-actin的纖維形態(tài)及排列異常，出現(xiàn)大量板狀偽足和應(yīng)力纖維；黃芪甲苷組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞漿中F-actin分布減少，神經(jīng)元形態(tài)與正常對照組相近；RhoA激動劑組大鼠F-actin的纖維形態(tài)及排列異?，F(xiàn)象進(jìn)一步加重。（見圖3）

圖3 鬼筆環(huán)肽染色法檢測F-actin在神經(jīng)元中的分布圖（×1000）

2.6 各組大鼠腦皮質(zhì)組織RhoA與MAP2陽性表達(dá)比較 MAP2標(biāo)記的神經(jīng)元顯紅色熒光，RhoA可陽性表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞漿中。模型組大鼠RhoA+MAP2+陽性表達(dá)數(shù)目高于正常對照組（P＜0.05）；黃芪甲苷組大鼠RhoA+MAP2+陽性表達(dá)數(shù)目低于模型組（P＜0.05）；RhoA激動劑組大鼠RhoA+MAP2+陽性表達(dá)數(shù)目高于模型組和黃芪甲苷組（P＜0.05）；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠RhoA+MAP2+陽性表達(dá)數(shù)目高于黃芪甲苷組（P＜0.05）。（見圖4、表3）

圖4 各組大鼠腦皮質(zhì)組織RhoA與MAP2免疫熒光雙染圖（×200）

表3 各組大鼠腦皮質(zhì)組織RhoA 與MAP2 陽性表達(dá)水平比較（）

表3 各組大鼠腦皮質(zhì)組織RhoA 與MAP2 陽性表達(dá)水平比較（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷組比較，cP＜0.05

2.7 各組大鼠腦皮質(zhì)組織中ROCK2陽性表達(dá)比較 ROCK2在正常對照組大鼠腦皮質(zhì)組織神經(jīng)元中呈弱陽性表達(dá)；與正常對照組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)組織中ROCK2陽性表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腦皮質(zhì)組織中ROCK2陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織中ROCK2陽性表達(dá)明顯高于模型組和黃芪甲苷組（P＜0.05）；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織中ROCK2陽性表達(dá)明顯高于黃芪甲苷組（P＜0.05）。（見圖5、表4）

表4 各組大鼠腦皮質(zhì)組織ROCK2 陽性表達(dá)水平比較（）

表4 各組大鼠腦皮質(zhì)組織ROCK2 陽性表達(dá)水平比較（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷組比較，cP＜0.05

圖5 各組大鼠腦皮質(zhì)組織ROCK 蛋白的免疫組化染色圖（×200）

2.8 各組大鼠腦皮質(zhì)組織Nogo-A、LPA蛋白表達(dá)比較 與正常對照組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nogo-A、LPA蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nogo-A、LPA蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nogo-A、LPA蛋白相對表達(dá)量明顯高于模型組和黃芪甲苷組（P＜0.05）；黃芪甲苷+RhoA激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nogo-A、LPA蛋白相對表達(dá)量明顯高于黃芪甲苷組（P＜0.05）。（見圖6、表5）

圖6 各組大鼠腦皮質(zhì)組織Nogo-A、LPA 蛋白免疫印跡圖

表5 各組大鼠腦皮質(zhì)組織Nogo-A、LPA 蛋白相對表達(dá)量比較（）

表5 各組大鼠腦皮質(zhì)組織Nogo-A、LPA 蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芪甲苷組比較，cP＜0.05

3 討 論

BM病死率及病殘率較高，據(jù)流行病學(xué)分析，GBS感染引起的BM，可導(dǎo)致約10%的患兒死亡，35%左右的患兒發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，BM不良預(yù)后，與GBS等致病菌感染腦膜及皮質(zhì)組織后，引起的神經(jīng)元損傷及凋亡有關(guān)[9]。胡婧婧等[10]認(rèn)為細(xì)菌感染后引起的炎癥刺激及中樞神經(jīng)損傷是導(dǎo)致BM患兒死亡和傷殘的主要原因，并認(rèn)為BM患兒腦脊液中神經(jīng)元損傷后釋放物質(zhì)——NSE水平及炎癥敏感且特異的標(biāo)志物——PCT等水平越高，預(yù)示BM預(yù)后及轉(zhuǎn)歸越差。TNF-α是細(xì)菌感染標(biāo)志物，DINIZ A M M等[11]發(fā)現(xiàn)BM患者血清及腦脊液中TNF-α水平明顯高于正常人群。本研究經(jīng)新生大鼠側(cè)腦室注射GBS后，大鼠腦脊液中TNF-α水平增多的同時，NSE及PCT水平也高于正常對照組，且大鼠死亡、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及凋亡現(xiàn)象也顯著增加，提示GBS感染后，大鼠出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡及損傷現(xiàn)象，表明造模成功。臨床上常采用抗生素及糖皮質(zhì)激素藥物來改善BM神經(jīng)并發(fā)癥和延緩死亡進(jìn)程，但隨著致病菌進(jìn)化、耐藥菌增加等多種因素的產(chǎn)生，BM的診治問題也日益突出[12]。現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪中的活性成分黃芪甲苷具有抗鏈球菌作用[13]，且對神經(jīng)元也有保護(hù)作用[5]，預(yù)示黃芪甲苷也可能為治療BM神經(jīng)元感染性損傷的潛在藥物。本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷干預(yù)療BM大鼠后，大鼠死亡減少，腦脊液中TNF-α、NSE及PCT水平明顯降低，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及凋亡也顯著緩解，證實了黃芪甲苷對BM大鼠神經(jīng)元損傷有改善作用，但其改善作用的具體機制還需進(jìn)一步研究。

RhoA/ROCK2通路在神經(jīng)元分化及神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程中發(fā)揮了重要作用。研究[14-15]發(fā)現(xiàn)RhoA及ROCK2是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要效應(yīng)分子，其激活可抑制神經(jīng)軸突生長發(fā)育，引起細(xì)胞骨架重構(gòu)及異常收縮，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、神經(jīng)軸突生長錐塌陷丟失，而參與神經(jīng)退行性病變過程；體內(nèi)外實驗證實RhoA/ROCK2激活可促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，阻斷RhoA/ROCK2通路激活，抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性修復(fù)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)BM大鼠RhoA與腦皮質(zhì)神經(jīng)元陽性共表達(dá)數(shù)目增多，且ROCK2在神經(jīng)元中呈強陽性表達(dá)，大鼠神經(jīng)元凋亡率也顯著降低，提示BM大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元中RhoA/ROCK2通路激活，可能是BM大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及凋亡的潛在影響因素。

另外，F(xiàn)-actin是細(xì)胞骨架重排的重要標(biāo)志物，也是RhoA/ROCK2通路的下游效應(yīng)分子。盧葉等[18]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染后，TNF-α可激活RhoA/ROCK2通路，刺激F-actin在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中聚集，從而促進(jìn)細(xì)胞增粗、排列紊亂，引起細(xì)胞骨架重排，導(dǎo)致細(xì)胞通透性改變及損傷。本研究也檢測到F-actin在BM大鼠神經(jīng)元中分布增多，推測細(xì)菌感染后，RhoA/ROCK2通路激活，引起下游分子F-actin在神經(jīng)元中聚集，導(dǎo)致神經(jīng)元骨架改變、損傷及凋亡。LPA可與神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生的髓鞘抑制性信號效應(yīng)分子——Nogo-A相互作用，促進(jìn)RhoA/ROCK2通路激活及細(xì)胞骨架重排[19]。本研究于BM大鼠側(cè)腦室注射RhoA激動劑后，大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元LPA及Nogo-A蛋白表達(dá)，RhoA/ROCK2通路激活，以及細(xì)胞F-actin分布進(jìn)一步增加的同時，大鼠死亡、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及凋亡也進(jìn)一步加重，提示激活RhoA/ROCK2通路，可加劇BM大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷和凋亡。XIE S H等[20]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過抑制RhoA基因表達(dá)來改善腸屏障損傷，預(yù)示黃芪甲苷可能對RhoA相關(guān)通路表達(dá)有干預(yù)作用。本研究顯示黃芪甲苷改善BM大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及凋亡的同時，大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元LPA及Nogo-A蛋白表達(dá)，RhoA/ROCK2通路激活，以及細(xì)胞F-actin分布均受到抑制，而RhoA激動劑LPA可逆轉(zhuǎn)黃芪甲苷的上述作用。

綜上所述，黃芪甲苷可抑制BM大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元中RhoA/ROCK2通路激活，抑制神經(jīng)元骨架重構(gòu)，緩解神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及凋亡。這可能為黃芪甲苷治療BM的機制提供一定參考。但BM細(xì)菌遷移與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的網(wǎng)絡(luò)機制較為復(fù)雜，黃芪甲苷改善BM神經(jīng)系統(tǒng)損傷的其他機制，還有待后續(xù)深入研究。