劉江紅，蘇會(huì)敏，薛 健，魏曉航

(1.東北石油大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 大慶 163318；2.西安凱立新材料股份有限公司，陜西 西安 710201)

隨著染料生產(chǎn)和印染工業(yè)的發(fā)展，染料廢水的排放量急劇增加，全球印染染料產(chǎn)量超過100萬(wàn)t/a，約有5%～10%的染料隨廢水排放出去[1-2]。染料廢水是一種難處理的工業(yè)廢水，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，破壞生態(tài)平衡，威脅人體健康。傳統(tǒng)的物理法和化學(xué)法具有成本高、效率低、易產(chǎn)生二次污染的缺點(diǎn)，而生物法具有成本低、安全、無(wú)污染、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種可以脫色染料的微生物，主要包括真菌、細(xì)菌和藻類等[3]，生物法具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。作者從染料廢水中篩選出一株青霉菌，用以脫色亞甲基藍(lán)染料廢水，探究不同因素對(duì)青霉菌脫色亞甲基藍(lán)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

菌種：實(shí)驗(yàn)所用染料降解菌來(lái)自于染料廢水樣品，篩選出的菌株于實(shí)驗(yàn)室冰箱中冷藏保存。

亞甲基藍(lán)：天津博迪化工股份有限公司；蔗糖：生物試劑，氯化鈣：分析純，天津市耀華化工廠；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸二氫鉀：分析純，天津市塘沽鵬達(dá)化工廠。

電熱恒溫培養(yǎng)箱：SYQ-DSX-280B，南京曉曉儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：HZQ-X100，常州恒隆儀器有限公司；pH計(jì)：pHS-3C，濟(jì)南光耀醫(yī)療設(shè)備有限公司；可見分光光度計(jì)：722E，北京瑞青橙儀器儀表有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)：T6，華威科創(chuàng)(武漢)科技有限公司；傅里葉紅外光譜儀：Nicolet 6700，美國(guó)熱電公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的處理

(1)真菌馴化培養(yǎng)基：NaNO32.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，KCl 0.5 g，蔗糖30 g，pH=7，121 ℃滅菌20 min。

(2)染料降解培養(yǎng)基(MSM)：(NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2 H2O 0.01 g，KH2PO41.5 g，K2HPO41.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖10 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌 25 min。

1.2.2 微生物的馴化

馴化實(shí)驗(yàn)在250 mL錐形瓶中進(jìn)行(培養(yǎng)液體積50 mL)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，t=35 ℃。采用逐步提升染料濃度的馴化方法，馴化期約30 d，具體馴化流程見圖1。

圖1 高效染料降解菌篩選、分離、純化流程

1.2.3 血球計(jì)數(shù)法配制孢子懸液

在超凈工作臺(tái)上，將少量w(NaCl)=0.9%的生理鹽水倒入覆蓋著青霉菌孢子的固體培養(yǎng)基中，緩慢搖晃，然后倒入250 mL錐形瓶中。重復(fù)幾次可獲得高濃度的青霉菌孢子懸液，在搖瓶中加適量w(NaCl)=0.9%的生理鹽水至100 mL，振蕩一段時(shí)間使孢子呈均勻分散狀態(tài)。將蓋玻片置于鏡檢后的血球計(jì)數(shù)板上，搖勻孢子懸液，用滅菌后的膠頭滴管吸取1滴，沿蓋玻片邊緣滴入計(jì)數(shù)室，對(duì)計(jì)數(shù)室內(nèi)的孢子個(gè)數(shù)進(jìn)行3次計(jì)數(shù)，取平均值[5-7]。孢子懸液濃度計(jì)算見公式(1)。

(1)

式中：孢子懸液濃度，個(gè)/mL；N為平均10個(gè)格內(nèi)孢子數(shù)，個(gè)。

取250 mL錐形瓶，加入100 mL染料降解培養(yǎng)基，用滅菌后的移液管移取孢子懸液，將φ(青霉菌孢子)=1%的接種懸液(濃度為107個(gè)/mL)置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，即接種后培養(yǎng)基中孢子濃度為105個(gè)/mL，留置備用。

1.2.4 脫色效率的測(cè)定

取上清液3 mL，n=9 000 r/min離心10 min，于亞甲基藍(lán)最大吸收波長(zhǎng)(660 nm)下測(cè)定吸光度(At)，以未被處理的青霉菌處理亞甲基藍(lán)溶液的吸光度(A0)為對(duì)照，空白染料降解培養(yǎng)基為參比，亞甲基藍(lán)的脫色效率見公式(2)[8-10]。

(2)

1.2.5 不同因素對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

考察青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)的過程中，各因素對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響。亞甲基藍(lán)的脫色實(shí)驗(yàn)在初始亞甲基藍(lán)濃度、青霉菌孢子懸液接種量、pH值(通過滴加0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié))、時(shí)間和鹽度等不同條件下進(jìn)行。

1.2.6 青霉菌脫色亞甲基藍(lán)的機(jī)理探究

1.2.6.1 青霉菌脫色亞甲基藍(lán)前、后機(jī)理的實(shí)驗(yàn)探究

取4個(gè)250 mL錐形瓶，分別標(biāo)記1#、2#、3#和4#。用移液管移取ρ(亞甲基藍(lán))=1 g/L的母液2 mL，使最終溶液ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L，將φ(真菌孢子)=3%的懸液接種染料降解培養(yǎng)基中，n=120 r/min恒溫35 ℃培養(yǎng)，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)操作。(1)1#瓶經(jīng)n=7 000 r/min離心5 min，每隔24 h測(cè)定吸光度值，計(jì)算脫色效率。(2)2#瓶培養(yǎng)超過48 h，直至溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)榘咨?，并不再發(fā)生變化后取出。n=8 000 r/min高速離心脫色菌體，上清液即為粗酶液。取整瓶粗酶液，加入亞甲基藍(lán)原溶液，使最終溶液ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L，n=150 r/min恒溫培養(yǎng)超過48 h，每隔24 h測(cè)定一組吸光度值，直至吸光度值不再發(fā)生變化為止。(3)3#瓶和4#瓶分別培養(yǎng)24和48 h之后取出，經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min，致菌體死亡，測(cè)定吸光度值并計(jì)算脫色效率。

1.2.6.2 青霉菌脫色亞甲基藍(lán)前、后的紫外分析

在染料降解培養(yǎng)基中以ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L、懸液接種量φ(青霉菌孢子)=3%為條件，在培養(yǎng)前(0 h)和亞甲基藍(lán)完全脫色后(72 h)分別取10 mL混合液通過離心(9 000 r/min，5 min)的方式去除菌體，并利用紫外-可見分光光度計(jì)的掃描功能分析混合液上清液的紫外譜圖變化。

1.2.6.3 亞甲基藍(lán)脫色前、后紅外光譜分析

將φ(青霉菌孢子)=3%的懸液接種至染料降解培養(yǎng)基中，n=120 r/min恒溫培養(yǎng)72 h，通過離心制備青霉菌粗酶液100 mL，通過移液管向青霉菌粗酶液中加入ρ(亞甲基藍(lán))=1 g/L的溶液2 mL，使最終溶液中的ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L，恒溫振蕩48 h，溶液中亞甲基藍(lán)無(wú)殘留，由于青霉菌產(chǎn)生的還原物質(zhì)和酶的共同作用使亞甲基藍(lán)全部斷鏈，進(jìn)而被脫色。在用壓片機(jī)給KBr壓片后，分別滴加脫色前ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L溶液和脫色后ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L溶液進(jìn)行紅外光譜分析(FTIR)。

2 結(jié)果與討論

2.1 真菌篩選結(jié)果與鑒定

2.1.1 不同菌株對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的對(duì)比

不同菌株對(duì)ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L溶液的脫色效率見圖2。

t/h圖2 不同菌株對(duì)亞甲基藍(lán)的脫色效率

由圖2可知，t=72 h，菌株1的亞甲基藍(lán)脫色效率為85.21%，t=96、120 h的脫色效率變化不大。t=72 h，菌株2的亞甲基藍(lán)脫色效率為55.41%，t=96、120 h的脫色效率為67.23%、72.13%，仍有繼續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，考慮亞甲基藍(lán)的脫色時(shí)間和脫色效率2個(gè)因素，所以選用菌株1作為后續(xù)研究菌株。

2.1.2 菌株1的16S rDNA的分子鑒定

菌株1的形態(tài)和生理模式顯示了與青霉菌的高度相似性。菌株的16S rDNA序列與NCBI GenBank和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，可鑒定該序列為青霉菌(PencillumexpansumKU162972，簡(jiǎn)稱P1)，基因同源性相似度達(dá)99%。菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 P1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 不同因素對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

2.2.1 初始ρ(亞甲基藍(lán))對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

青霉菌P1在初始ρ(亞甲基藍(lán))=0、20、40、60、80和100 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，對(duì)不同ρ(亞甲基藍(lán))溶液的脫色效率見圖4。

t/h圖4 初始ρ(亞甲基藍(lán))對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

由圖4可知，隨著ρ(亞甲基藍(lán))逐漸升高，脫色效率逐漸降低。ρ(亞甲基藍(lán))=40～100 mg/L，脫色效率明顯下降。分析原因可能是ρ(亞甲基藍(lán))過高對(duì)青霉菌P1產(chǎn)生了一定的毒性，抑制青霉菌P1的正常生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致亞甲基藍(lán)脫色效率的下降。

2.2.2φ(青霉菌P1孢子)對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

φ(青霉菌P1孢子)對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響見圖5。

由圖5可知，φ(青霉菌P1孢子)=1%～3%，脫色效率隨著φ(青霉菌P1孢子)的增加而增加，而φ(青霉菌P1孢子)=4%～5%，脫色效率變化很小，分析原因可能是在特定的反應(yīng)體系中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限度，微生物不能無(wú)限繁殖，隨著微生物代謝產(chǎn)物的增加和營(yíng)養(yǎng)物的消耗，導(dǎo)致脫色效率不再升高。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，最佳接種量選擇φ(青霉菌P1孢子)=4%。

φ(青霉菌P1孢子)/%圖5 φ(青霉菌P1孢子)對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

2.2.3 pH值對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

pH值對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響見圖6。

pH圖6 pH值對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

由圖6可知，pH=1～3，亞甲基藍(lán)的脫色效率逐漸上升；pH=4，脫色效率達(dá)到最大值94.95%；pH=5～7，脫色效率逐漸下降；pH=8～9，亞甲基藍(lán)的脫色效率僅為26.52%和13.26%，呈下降趨勢(shì)。酸性條件下對(duì)亞甲基藍(lán)的脫色效率明顯高于堿性，青霉菌P1很有可能是一種嗜酸菌，在酸性條件下更有利于生長(zhǎng)。pH=8～9，溶液呈堿性，影響了青霉菌P1的生長(zhǎng)，導(dǎo)致亞甲基藍(lán)的脫色效率明顯下降。因此，青霉菌最適宜的降解亞甲基藍(lán)染料選擇pH=4。

2.2.4 時(shí)間對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

脫色時(shí)間是影響微生物脫色能力的重要因素，適宜的反應(yīng)時(shí)間不僅能使微生物充分發(fā)揮作用，還能節(jié)約反應(yīng)時(shí)間及成本，對(duì)實(shí)際工程應(yīng)用有很大的影響，時(shí)間對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響見圖7。

由圖7可知，青霉菌P1在培養(yǎng)t=4～20 h，亞甲基藍(lán)脫色效率呈快速上升趨勢(shì)；在培養(yǎng)t=24、28 h，脫色效率分別為93.09%、95.37%，呈緩慢上升趨勢(shì)。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中，考慮實(shí)驗(yàn)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本，青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)的最適宜脫色時(shí)間選擇24 h。

t/h圖7 時(shí)間對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

2.2.5 鹽度對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

染料廢水通常具有較高的含鹽量。在實(shí)際染料廢水處理過程中，研究鹽度對(duì)青霉菌P1生長(zhǎng)和染料脫色的影響具有重要意義。鹽度對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響見圖8。

w(鹽度)/%圖8 鹽度對(duì)亞甲基藍(lán)脫色效率的影響

由圖8可知，隨著鹽度的逐漸升高，青霉菌對(duì)亞甲基藍(lán)的脫色效率逐漸降低，下降趨勢(shì)明顯，說(shuō)明鹽度可能抑制青霉菌P1對(duì)亞甲基藍(lán)的脫色作用。鹽度w(NaCl)=6%，脫色效率為90.3%，說(shuō)明青霉菌P1具有耐受高鹽度的能力，在實(shí)際處理染料廢水的過程中具有應(yīng)用價(jià)值[11-12]。

2.3 青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)的機(jī)理探究

2.3.1 青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)的實(shí)驗(yàn)機(jī)理探究

青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)的實(shí)驗(yàn)機(jī)理探究結(jié)果見表1。

表1 青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)前、后機(jī)理的實(shí)驗(yàn)探究

由表1可知，1#瓶隨著時(shí)間的增加，青霉菌P1孢子不斷增長(zhǎng)，對(duì)亞甲基藍(lán)的脫色效率也逐漸增加；2#瓶表明這些酶類確實(shí)能使亞甲基藍(lán)脫色。結(jié)合1#瓶、3#瓶和4#瓶，48 h兩者的差值為青霉菌P1吸附亞甲基藍(lán)的效率20.27%。說(shuō)明在該脫色過程中，亞甲基藍(lán)的脫色是生物降解和生物吸附共同作用的結(jié)果。

2.3.2 青霉菌脫色亞甲基藍(lán)前、后的紫外圖譜分析

青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)前、后的紫外譜圖見圖9。

λ/nm圖9 青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)前、后的紫外譜圖

由圖9可知，未處理的亞甲基藍(lán)染料分別在波長(zhǎng)為291和660 nm有特征吸收峰(其中660 nm為最大吸收波長(zhǎng))，經(jīng)過5 d脫色處理后，660 nm的吸收峰明顯下降。由文獻(xiàn)可知[13]，微生物脫色亞甲基藍(lán)的方式有生物吸附和生物降解2種，生物吸附過程中紫外譜圖的吸收峰具有同步降低的現(xiàn)象，生物降解過程中紫外譜圖會(huì)具有主吸收峰的消失并出現(xiàn)新吸收峰的現(xiàn)象。青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)的紫外譜圖有明顯波形變化，并且有新的吸收峰出現(xiàn)，可以判斷脫色過程是由降解作用引起的。由青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)前、后的紫外譜圖對(duì)比，可以看出亞甲基藍(lán)的分子峰發(fā)生藍(lán)移，具有減色效應(yīng)，660和291 nm的2個(gè)明顯的吸收峰分別對(duì)應(yīng)發(fā)色基團(tuán)(—S—)吸收峰和苯環(huán)(吩噻嗪結(jié)構(gòu))吸收峰。由此猜測(cè)，在降解過程中，發(fā)色基團(tuán)斷鏈，降解后中間產(chǎn)物的苯環(huán)數(shù)相對(duì)于亞甲基藍(lán)的苯環(huán)數(shù)有所增加，或中間產(chǎn)物具有吩噻嗪結(jié)構(gòu)[14-15]。

2.3.3 青霉菌脫色亞甲基藍(lán)前、后的紅外譜圖分析

青霉菌脫色亞甲基藍(lán)前、后的紅外譜圖分析見圖10。

σ/cm-1圖10 青霉菌P1脫色前、后代謝物的紅外譜圖

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)從染料廢水中篩選出青霉菌P1(PencillumexpansumKU162972)，探究不同因素對(duì)青霉菌脫色亞甲基藍(lán)脫色效率的影響，并且利用紫外分光光度計(jì)和傅里葉紅外光譜探究青霉菌P1對(duì)亞甲基藍(lán)的脫色機(jī)理。

(1)考察不同因素對(duì)青霉菌P1脫色亞甲基藍(lán)脫色效率的影響，在ρ(亞甲基藍(lán))=20 mg/L、接種量φ(青霉菌孢子)=4%、pH=4和鹽度w(NaCl)=2%條件下，亞甲基藍(lán)的脫色效率可達(dá)92.33%；

(2)由紫外光譜分析可知，青霉菌脫色亞甲基藍(lán)的紫外譜圖有明顯波形變化并且有新的吸收峰出現(xiàn)，可判斷脫色過程具有生物降解作用；

(3)由紅外光譜分析可知，亞甲基藍(lán)和代謝物紅外光譜的差異表明亞甲基藍(lán)的結(jié)構(gòu)部分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，與之前實(shí)驗(yàn)探究機(jī)理和紫外光譜分析相同，說(shuō)明亞甲基藍(lán)脫色過程是生物降解和生物吸附共同作用的結(jié)果。