陳彥輝，董建方，朱銀龍，周學(xué)義，馮天霞，張建波，劉 樂

（寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司，寧夏中寧755100）

枸杞（Lycium barbarumL.）是一種多年生茄科灌木植物，其果實(shí)枸杞子長1～2 cm，呈鮮橙紅色橢圓形[1-3]。作為一味傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥，枸杞具有極高的藥用、食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。枸杞子中富含枸杞多糖、類胡蘿卜素、多酚等活性成分，具有抗氧化、提高免疫力等優(yōu)良的生物活性[4-5]。乳酸菌是一類利用碳水化合物發(fā)酵且主要產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱[6]。發(fā)酵過程中除了產(chǎn)生大量乳酸外，還伴隨有酯類等風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，可以充分提升產(chǎn)品風(fēng)味、香氣感官特征、抗氧化能力，在食品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用[7-9]。發(fā)酵型枸杞酒是以枸杞為原料發(fā)酵而成的低度飲料酒，果香濃郁、口感馥郁，兼具較好的營養(yǎng)價(jià)值。大部分果酒的釀造工藝主要是在葡萄酒的釀造工藝基礎(chǔ)上，根據(jù)自身原料的特性進(jìn)行改良，枸杞酒也不例外。葡萄酒的發(fā)酵主要分為2個階段，即前發(fā)酵和后發(fā)酵，前發(fā)酵主要是酒精發(fā)酵，糖分在酵母的作用下轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳，后發(fā)酵則主要是進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，蘋果酸在明珠串菌的作用下轉(zhuǎn)化為乳酸[10-11]。通過蘋-乳發(fā)酵可避免蘋果酸帶來的粗糙酸澀感，使口感變得柔軟順滑，同時(shí)可以提高酒體的生物穩(wěn)定性以及增加酒體風(fēng)味復(fù)雜性[12]。枸杞酒受限于原料本身特性，在釀造過程中不具備觸發(fā)蘋乳發(fā)酵的條件，這可能與枸杞發(fā)酵酒酒體略顯單薄，酒體風(fēng)味物質(zhì)不夠豐富存在一定的關(guān)聯(lián)，從而影響消費(fèi)者的飲用感官和枸杞酒的市場銷量。

文獻(xiàn)檢索表明，目前針對枸杞酒風(fēng)味物質(zhì)提升的研究熱點(diǎn)主要集中于釀酒酵母、非釀酒酵母的篩選，未見采用乳酸菌發(fā)酵提升枸杞酒體風(fēng)味物質(zhì)的報(bào)道。這主要是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵過程中，產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì)的同時(shí)，伴隨有大量乳酸的產(chǎn)生。如何在不破壞酒體風(fēng)味的前提下中止乳酸發(fā)酵以及如何解決大量乳酸帶來的酸感突出破壞酒體協(xié)調(diào)性的問題，是制約乳酸菌發(fā)酵應(yīng)用于果酒釀造的主要因素。本工藝采用乳酸菌發(fā)酵，提升酒體風(fēng)味物質(zhì)含量，改良枸杞酒品質(zhì)。采用陶瓷膜過濾分離出乳酸菌，中止乳酸發(fā)酵過程。分離出的乳酸菌截留液，經(jīng)真空冷凍干燥、調(diào)配后制作為高附加值產(chǎn)品——益生菌粉。通過控制乳酸發(fā)酵程度、水稀釋、甘油調(diào)配來平衡乳酸過量導(dǎo)致的酸感突出問題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：枸杞鮮果，寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司石喇叭種植基地。

菌株：乳酸菌VEGE092，杜邦丹尼斯克（中國）有限公司；AC酵母，天津盛豐商貿(mào)有限公司。

試劑及耗材：D-異抗壞血酸鈉，江西百勤異VC鈉有限公司；低聚木糖，河南源隆生物科技有限公司；抗性糊精、硅酸鈣，同發(fā)食化商貿(mào)有限公司；麥芽糊精，山東西王糖業(yè)有限公司；焦亞硫酸鉀、明膠、膨潤土、甘油，濰坊凱澤釀酒材料有限公司；果膠酶，湖南尤特爾生化有限公司；白砂糖，云南鳳慶糖業(yè)集團(tuán)有限公司；DPPH，沃瑞達(dá)斯實(shí)驗(yàn)試劑耗材；ABTS，酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建成生物工程研究所；硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀、無水乙醇，均為分析純，銀川華廈化工有限責(zé)任公司。

儀器設(shè)備：DJ型雙道打漿機(jī)，江蘇漢隆機(jī)械制造有限公司；四連體發(fā)酵罐，武漢顯海機(jī)械設(shè)備有限公司；PHS-3E pH（酸度）計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LPS-125CH真空冷凍干燥機(jī)，無錫萊浦儀器設(shè)備有限公司；YB-800B多功能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；SJM-FHM陶瓷復(fù)合膜分離設(shè)備，合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司；數(shù)顯折光儀，廣州市愛宕科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，力辰儀器科技有限公司；潔凈工作臺，濟(jì)南鑫貝生物技術(shù)有限公司；濁度計(jì)，上海昕瑞儀器儀表有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

本試驗(yàn)采用工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.2.2 操作要點(diǎn)

原料處理：新鮮采摘或采摘后及時(shí)冷凍等方式保存完好的鮮枸杞，揀除霉?fàn)€果、葉柄以及石粒、鐵塊等雜物。噴淋清洗、榨汁后轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，加入0.05%異抗壞血酸鈉進(jìn)行護(hù)色。執(zhí)行巴氏殺菌工藝后，冷卻。

乳酸菌接種：冷卻至37℃，接種乳酸菌。

乳酸菌發(fā)酵：菌種接入后，控溫37℃、密閉無氧發(fā)酵。監(jiān)測發(fā)酵醪滴定酸變化，滴定酸達(dá)到5 g/L時(shí)（以乳酸計(jì)），停止發(fā)酵。

陶瓷膜過濾：依次使用0.2%NaOH溶液、0.2%檸檬酸溶液、沸水清洗0.5 μm、0.2 μm膜孔徑規(guī)格陶瓷膜過濾設(shè)備。清洗完成后，進(jìn)行過濾。透過液加入硫至體系中游離二氧化硫含量為40 mg/L后轉(zhuǎn)入清洗好的發(fā)酵罐中備用。截留液進(jìn)行真空冷凍干燥，100目粉碎，使用低聚木糖25%、抗性糊精10%、麥芽糊精20%、硅酸鈣5%進(jìn)行調(diào)配，調(diào)配完成后裝瓶。

降酸：陶瓷膜過濾后期，反復(fù)加水稀釋，對糖分進(jìn)行洗脫，將透過液固形物含量降為5°Bx以下后，停止過濾。同時(shí)，稀釋過程也是降酸的過程，滴定酸控制為2.5 g/L。

酶解：發(fā)酵罐中加入50 mg/L果膠酶、復(fù)合酶，50℃酶解2 h。

發(fā)酵：0.1 g/L用量接種AC酵母，控溫15～18℃進(jìn)行發(fā)酵。待比重降低至1050～1060 g/L時(shí)，按照酒精度12%vol計(jì)算，分次補(bǔ)充適量白砂糖。

調(diào)配：使用甘油對口感進(jìn)行調(diào)整。

下膠：待發(fā)酵結(jié)束，加入硫至體系中游離二氧化硫含量為4 mg/L后，添加0.6 g/L膨潤土，執(zhí)行下膠工藝。

陳釀：下膠結(jié)束的發(fā)酵原酒轉(zhuǎn)入儲酒罐，-4℃冷處理15～20 d，使冷不穩(wěn)定性成分析出，同時(shí)有利于酒體陳釀。

除菌過濾：使用膜孔徑0.5 μm板框過濾機(jī)過濾，除去冷凍過程中析出的不穩(wěn)定成分，膜孔徑0.2 μm微濾膜過濾除去酵母、細(xì)菌。

灌裝：除菌過濾后，進(jìn)行無菌灌裝。

1.2.3 降酸方式的選擇

目前，果酒降酸的方式主要有化學(xué)降酸法、物理降酸法、生物降酸法、加水勾兌法[13-15]?；瘜W(xué)降酸法對酒體口感、香氣破壞較大，不適用于枸杞酒這種內(nèi)含物較單薄的酒體。物理降酸法可以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要有冷凍法、吸附法。冷凍法主要針對酒石酸鹽含量豐富的酒體，吸附法會導(dǎo)致酒體香氣損失[16]。目前，還未見生物降酸應(yīng)用于果酒工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。綜合考量，選擇加水勾兌法，在原料陶瓷膜處理階段降酸。在陶瓷膜過濾工段加水勾兌，一方面有利于枸杞汁中固形物的洗脫，另一方面可以充分混勻。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定以降酸料液比、乳酸發(fā)酵時(shí)間、乳酸菌接種量為3個主要影響因素，以感官評價(jià)值為測試指標(biāo)，確定發(fā)酵因素水平。

料液比：以20 DCU投料量發(fā)酵菌種加入發(fā)酵醪，37℃恒溫發(fā)酵24 h后，陶瓷膜過濾工段，加入2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5 體積比的純凈水降酸后進(jìn)行發(fā)酵，測定酒體滴定酸與感官評價(jià)值。

發(fā)酵時(shí)間：以20 DCU投料量發(fā)酵菌種加入發(fā)酵醪，37 ℃恒溫發(fā)酵6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h，陶瓷膜過濾工段1∶1加水勾兌后進(jìn)行發(fā)酵，測定酒體可滴定酸與感官評價(jià)值。

菌種接種量：以 10 DCU、20 DCU、30 DCU、40 DCU、50 DCU、60 DCU投料量發(fā)酵菌種加入發(fā)酵醪，37℃恒溫發(fā)酵24 h后，陶瓷膜過濾工段1∶1加水勾兌后進(jìn)行發(fā)酵，測定滴定酸與感官評價(jià)值。

1.2.5 正交試驗(yàn)

以降酸料液比、乳酸發(fā)酵時(shí)間、乳酸菌接種量為影響因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化乳酸發(fā)酵枸杞汁的工藝，以感官評分值為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵條件、因素、水平設(shè)置見表1。

表1 發(fā)酵工藝的試驗(yàn)因素水平表

1.2.6 感官評定

請公司研發(fā)、質(zhì)檢、生產(chǎn)部門無飲食偏好的人員共7人組成品評小組，按照表2對酒體的色澤、澄清度、香氣、口感進(jìn)行綜合評定，去掉最高分、最低分后，取平均值作為評分結(jié)果。

表2 發(fā)酵酒的感官評定表

1.2.7 下膠實(shí)驗(yàn)

以濁度值作為指標(biāo)，采用膨潤土(A)單一使用以及膨潤土(A)與明膠(B)復(fù)配進(jìn)行下膠、0.45 μm膜孔徑板框過濾，并對處理后的酒體進(jìn)行澄清效果評價(jià)、感官評分。

1.2.8 理化指標(biāo)分析

按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]分別測定寧夏紅12%vol金色傳杞酒（A）、乳酸菌發(fā)酵改良枸杞果酒(B)理化指標(biāo)，并做對比分析。

1.2.9 微生物實(shí)驗(yàn)

按照GB 4789.1—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》[18]、GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[19]、GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[20]分別測定寧夏紅12%vol金色傳杞酒（A）、乳酸菌發(fā)酵改良枸杞果酒（B）菌落總數(shù)、霉菌和酵母數(shù)，并做對比分析。按照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[21]測定益生菌枸杞粉（C）中乳酸菌數(shù)。

1.2.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.2.10.1 蛋白穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)）

取25 mL比色管加入25 mL酒樣，80℃水浴加熱30 min，24 h后進(jìn)行觀察,若酒體澄清透明、無沉淀，則酒體蛋白穩(wěn)定性合格。

1.2.10.2 氧化穩(wěn)定性

取50 mL三角瓶裝入50 mL酒樣，加入0.2 mL 15%雙氧水，常溫觀察48 h，若酒體澄清透明、無沉淀，則酒體氧化穩(wěn)定性合格。

1.2.10.3 微生物穩(wěn)定性

離心管中裝入酒樣，在4000 r/min下離心15 min，若底部無沉淀，則微生物穩(wěn)定性合格。

1.2.10.4 冷穩(wěn)定性

酒體在-4℃下觀察7 d，不出現(xiàn)沉淀，則酒體冷穩(wěn)定性合格。

1.2.10.5 銅穩(wěn)定性

取25 mL比色管加入25 mL酒樣，加入0.1 mL的10%亞硫酸，常溫條件下放置一周后觀察，若酒體澄清透明、無沉淀，則酒體銅穩(wěn)定性合格。

1.2.11 抗氧化分析

DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力的測定參照蘭永麗[22]的報(bào)道進(jìn)行，ABTS自由基清除能力的測定參照何瑞[23]的報(bào)道進(jìn)行，總抗氧化能力（FRAP法）的測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按照試劑盒的說明進(jìn)行操作，分別測定乳酸菌發(fā)酵改良枸杞酒、寧夏紅12%vol金色傳杞酒DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、總抗氧化能力，并做對比分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用 Excel、SPSS 23.0、Graphpad Prism 7對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

降酸料液比、乳酸菌發(fā)酵時(shí)間、乳酸菌接種量的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、圖3、圖4，各因素對感官評分值均有顯著性影響（p＜0.05）。料液比為1∶1、乳酸菌發(fā)酵時(shí)間為24 h、乳酸菌接種量在20 DCU時(shí)為最佳發(fā)酵條件。

圖2 料液比對發(fā)酵酒感官品質(zhì)的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵酒感官品質(zhì)的影響

圖4 乳酸菌接種量對發(fā)酵酒感官品質(zhì)的影響

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

以發(fā)酵酒的感官評分為指標(biāo)，確定了影響發(fā)酵酒感官品質(zhì)的因素順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間＞料液比＞乳酸菌接種量，最佳發(fā)酵條件為A2B2C1，即發(fā)酵酒的工藝條件為料液比1∶1，發(fā)酵時(shí)間24 h，乳酸菌接種量為20 DCU（表3），該條件下感官評分值為81分。

表3 發(fā)酵酒發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

對正交試驗(yàn)所得工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性發(fā)酵，所得發(fā)酵酒感官評分為83分，與正交試驗(yàn)結(jié)果相一致。

對感官評分進(jìn)行方差分析（表4）可知，料液比、發(fā)酵時(shí)間、接種量均對感官評分有顯著性影響（P＜0.05）。

表4 感官評分方差分析

2.2 發(fā)酵酒釀造過程中基礎(chǔ)理化指標(biāo)測定結(jié)果

如圖5、圖6、圖7表示，發(fā)酵酒釀造過程中基礎(chǔ)理化指標(biāo)的變化，發(fā)酵過程中的pH值和總酸含量對酒體的口感、風(fēng)味以及產(chǎn)品的貨架期均有較重要的影響。pH值在發(fā)酵過程中逐步降低，第11天降至最低，為3.94，然后逐漸上升直到發(fā)酵結(jié)束。與此同時(shí)，總酸在發(fā)酵0～8 d過程中逐漸增加，9～13 d逐漸減少，在最后2 d的發(fā)酵過程中有略微上升直到最終?？偹岷康脑黾又饕怯捎诎l(fā)酵過程中酵母產(chǎn)酸所致。發(fā)酵過程中，酵母不斷消耗糖分以及外源補(bǔ)糖，在發(fā)酵過程中總糖總體呈下降趨勢，至殘?zhí)呛繛? g/L，不再發(fā)生變化。同時(shí)產(chǎn)生大量酒精，酒精度逐步上升（從0%vol到12.5%vol）。

圖5 發(fā)酵酒釀造過程中酒精度變化

圖6 發(fā)酵酒釀造過程中總酸、pH值變化

圖7 發(fā)酵酒釀造過程中總糖含量變化

2.3 下膠實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。根據(jù)下膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果，0.6 g/L膨潤土用作澄清劑，澄清效果最佳且用量最少，避免過量吸附對酒體的破壞。

表5 發(fā)酵酒下膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 理化指標(biāo)分析

對寧夏紅12%vol金色傳杞酒(A)、乳酸菌發(fā)酵枸杞酒理化指標(biāo)(B)各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表6。乳酸菌發(fā)酵枸杞果酒滴定酸含量明顯高于寧夏紅12%vol金色傳杞。乳酸菌發(fā)酵枸杞果酒的干浸出物、色度指標(biāo)要低于寧夏紅12%vol金色傳杞，可能與多次執(zhí)行過濾工藝，導(dǎo)致部分物質(zhì)的損失及水稀釋比例過高有關(guān)。

表6 理化指標(biāo)對比分析

2.5 微生物檢驗(yàn)分析

對寧夏紅12%vol金色傳杞酒(A)、乳酸菌發(fā)酵枸杞酒(B)、益生菌粉(C)各項(xiàng)微生物指標(biāo)進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表7。兩款酒體的菌落總數(shù)、霉菌酵母菌數(shù)均低于80 CFU/750 mL，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。益生菌粉中乳酸菌活菌數(shù)達(dá)3.1×107CFU/g,具備一定的保健功效。

表7 微生物指標(biāo)對比分析

2.6 穩(wěn)定性分析

對寧夏紅12%vol金色傳杞酒、乳酸菌發(fā)酵枸杞酒進(jìn)行蛋白、氧化、微生物、冷、銅穩(wěn)定性指標(biāo)檢測，經(jīng)處理后，2種酒體觀察過程中呈現(xiàn)澄清、透明，均未出現(xiàn)沉淀，酒體穩(wěn)定性良好。

2.7 抗氧化性分析（圖8、圖9）

圖8 抗氧化能力對比分析

圖9 總抗氧化能力對比分析

經(jīng)乳酸菌發(fā)酵所得酒體DPPH自由基清除率與現(xiàn)有產(chǎn)品無顯著性差異，ABTS自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力均顯著高于現(xiàn)有產(chǎn)品?？寡趸阅艿臏y定結(jié)果與Kadyan[24]、Laaksonen等[25]的報(bào)道一致，乳酸菌發(fā)酵可以提升酒體的抗氧化性能。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)，確定乳酸發(fā)酵改良枸杞酒風(fēng)味的最佳工藝參數(shù)為：降酸料液比1∶1、乳酸發(fā)酵時(shí)間24 h、乳酸菌接種量20 DCU，各因素對發(fā)酵酒感官影響的主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間＞料液比＞乳酸菌接種量。通過下膠實(shí)驗(yàn)，確定最佳下膠方案為膨潤土0.6 g/L使用量下膠。發(fā)酵所得酒體滴定酸含量顯著高于現(xiàn)有產(chǎn)品，酸感更突出。干浸出物、色度指標(biāo)低于現(xiàn)有產(chǎn)品，可能與多次執(zhí)行過濾工藝及水稀釋比例過高有關(guān)。2款酒體菌落總數(shù)、霉菌酵母菌數(shù)檢測指標(biāo)均低于80 CFU/750 mL，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。益生菌粉中乳酸菌活菌數(shù)達(dá)3.1×107CFU/g，具備一定的保健功效?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)中，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵所得酒體DPPH自由基清除率與現(xiàn)有產(chǎn)品無顯著性差異，ABTS自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力均顯著高于現(xiàn)有產(chǎn)品，乳酸菌發(fā)酵可以提升酒體的抗氧化能力。

經(jīng)乳酸菌發(fā)酵改良的酒體，呈金黃色，具有柑橘類水果香氣，酒香、果香馥郁柔和，口感爽口、清新，產(chǎn)品品質(zhì)出色，具備較好的市場潛力。