王 雅，代 靜，劉先姜，張 濤

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在我國慢性肝病疾病譜中的占比逐年增長[1]。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）屬于NAFLD一部分，是在單純非酒精性脂肪肝輕度脂肪病變基礎上發(fā)生炎癥反應的一類疾病，增加了終末期肝病發(fā)生風險[2]。近年多項研究證實腸道微生物可影響腸道固有層免疫細胞，而其通過免疫識別受體作用肝細胞，導致肝臟炎癥反應。修復腸道免疫屏障功能，恢復其屏障功能以減輕肝臟炎癥反應，能阻斷NAFLD向NASH進展[3]，“菌-腸-肝”軸理論的提出為防治NASH的發(fā)生、發(fā)展提供理了論基礎[4]。疏肝理脾湯源于柴芍六君子湯，有改善肝臟炎癥、纖維化的療效[5]，但尚無關于其對腸道菌群調(diào)節(jié)方面的研究。因此，本研究以“菌-腸-肝”理論為依據(jù)，運用16srRNA高通量測序法，觀察疏肝理脾湯對NASH大鼠腸道菌群的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材 料

1.1 實驗動物8周齡健康、成年SPF級雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量（180±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（湘）2013-0005，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，本次研究經(jīng)過湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準，批件號：SYFY20170225，依照實驗動物3R原則給予人道關懷。

1.2 飼料 蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料配方：L-氨基酸175.7 g/kg，玉蜀黍淀粉150.0 g/kg，右旋麥芽糖50.0 g/kg，玉米油100.0 g/kg，纖維素30.0 g/kg，碳酸氫鈉7.4 g/kg，維生素混合物10.0 g/kg，鹽混合物35.0 g/kg。

1.3 藥物與試劑 疏肝理脾湯（方藥組成：柴胡15 g，茯苓15 g，白芍15 g，白術10 g，砂仁5 g，甘草5 g）由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。傳統(tǒng)中藥法煎制，水浴濃縮至生藥含量為2.0 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

糞便DNA小量提取試劑盒（美國Omega公司，批號：20190703）；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（美國AXYGEN公司，批號：20150606）；完全福氏佐劑F5881（美國Sigma公司，批號：9007-81-2）；不完全福氏佐劑F5506（美國Sigma公司，批號：SLBL9742V）。

1.4 主要儀器QuantiFluorTM ST藍色熒光定量系統(tǒng)（美國Promega公司）；UC-7超薄切片機（德國萊卡公司）；透射電鏡HT7700（日本日立高新技術公司）；電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5 造模與分組 適應性喂養(yǎng)1周大鼠，從56只大鼠中隨機選取8只作為正常對照組，剩余48只大鼠采用蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飲食聯(lián)合慢性束縛應激刺激法復制NASH大鼠模型：造模大鼠給予蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飲食，每天投食量為10 g/100 g，每天飲水量為12 mL/100 g。參照國內(nèi)肝郁脾虛證動物模型通行方法，給予饑飽失常飲食[6-7]，即第1天給予常規(guī)量MCD飲食，第2天禁食，均不禁水，同時給予慢性束縛應激刺激，即每日將小鼠放置于束縛制動筒內(nèi)限制活動4 h，束縛開始時間不固定，同時保持束縛期間禁食、禁水。各大鼠每周稱體質(zhì)量，依照體質(zhì)量調(diào)整投食量和飲水量。5周后，觀察各組大鼠進食、飲水、行為、活動、精神狀態(tài)、毛發(fā)及二便等情況，正常對照組與造模組分別隨機抽取2只大鼠行肝臟病理切片檢測，評判造模結果。將剩余46只造模成功大鼠依照隨機數(shù)字表法分為模型組（15只）、疏肝理脾低劑量組（16只）、疏肝理脾高劑量組（15只）。

1.6 實驗給藥 給藥期間所有大鼠均給予正常飲食。參照陳奇主編《中藥藥理研究方法學》計算給藥量，折算后疏肝理脾高、低劑量組大鼠生藥灌胃量分別為6.18、1.78 g/kg，灌胃體積為10 mL/kg；模型組和正常對照組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，均于每天14:30:00灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥4周。末次給藥后12 h禁食，稱重，按體質(zhì)量予以10%水合氯醛，0.35 mL/100 g標準對大鼠進行麻醉。

1.7 觀察指標 給藥第4周末，每組選取6只大鼠采集約1 g新鮮糞便，放入EP管中-80℃低溫冰箱保存固定，進行16srRNA腸道菌群多樣性檢測。操作人員予D4015提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。ABI GeneAmp 9700，TransGen AP221-02型儀按指定測序區(qū)域，合成barcode的特異引物。采用2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR混合產(chǎn)物，切膠回收PCR產(chǎn)物（AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司），進行Tris_HCI洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。引物序列號為338F ACTCC TACGGGAGGCAGCAG；806R GGA CTACHVGGGTWTCTAAT，參照電泳初步定量結果，運用QuantiFluortTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)檢測定量，而后予Miseq測序，分析腸道菌群16srRNA多樣性。

1.8 統(tǒng)計學方法 首先對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾處理，處理后的數(shù)據(jù)進行過濾得到有效數(shù)據(jù)，保證OTU（operational taxonomic units）聚類及后續(xù)分析的準確性，然后基于有效數(shù)據(jù)進行OTU聚類/去噪和物種分類分析，形成OTU和其他物種分類等級的物種豐度譜?；跀?shù)據(jù)均一化后的OTU物種豐度譜，再對OTU進行豐度、多樣性指數(shù)等分析，并對物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。Kruskal Wallis和ANOVA的分析運用qiime1 group_significance.py腳本，ANCOM的分析運用qiime2 composition ancom命令。ANCOM、Kruskal Wallis和ANOVA用于多組間豐度差異的顯著性檢驗。Kruskal Wallis和ANOVA提供檢驗統(tǒng)計量（Test-Statistic），總的P值（P），校正錯誤發(fā)現(xiàn)率P值（FDR_P），Bonferroni校正P值（Bonferroni_P），以及各分組均值，但不提供多重比較的結果；ANOVA是參數(shù)檢驗，要求豐度服從正態(tài)分布，而大部分物種的豐度都是不服從正態(tài)分布的；Kruskal Wallis屬于非參數(shù)檢驗，對分布沒有要求，較為適合菌群分析。LEfSe方法是非參數(shù)檢驗和線性判別分析的結合，適合菌群豐度差異檢驗。以上均采用R語言統(tǒng)計V4.0.1版統(tǒng)計軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 造模評價5周后，正常對照組大鼠毛發(fā)光澤，正常作息，飲食量及情緒無明顯變化；造模組大鼠毛發(fā)晦暗，無光澤，前期表現(xiàn)極度易激惹，后期表現(xiàn)情緒低落，倦怠少運動，飲食量減少，大便稀溏等類似中醫(yī)肝郁脾虛證之象。

光鏡下正常對照組大鼠肝細胞形態(tài)規(guī)則，胞漿清透，大小一致，肝竇清晰；造模組可見彌漫性、大泡性脂肪變性及氣球樣變，腺泡內(nèi)可見明顯點、灶狀壞死，散在可見淋巴細胞、炎癥細胞浸潤，提示造模成功（見圖1）。

圖1 大鼠肝臟組織病理檢測（HE，×100）

2.2 腸道菌群測序序列分析、OUTs分析結果 共24份糞便樣本采得3 276 796條序列，樣本序列共測得數(shù)值計3 276 796，采得樣本中最大序列數(shù)為90 623，最小序列數(shù)為35 102，平均序列數(shù)共計45 511.05。

2.3 大鼠腸道菌群OUTs分析結果 對所有樣品進行樣品物種組成及多樣性信息分析。依照界水平（Kingdom）、門水平（Phylum）、綱水平（Class）、目水平（Order）、科水平（Family）、屬水平（Genus）、種水平（Species）對所有樣本通過Illumina MiSeq測序平臺進行OTU絕對豐度信息聚類分析。對每個樣品在界門綱目科屬種7個分類水平上的序列數(shù)目占總序列數(shù)的比例進行統(tǒng)計，可以有效地評估樣本的物種注釋分辨率（注釋到屬/種的比例越高表示樣本的OTU注釋效果越好），圖2展示了每個樣本中OTU在各分類水平注釋的相對程度。因注釋到種水平的物種數(shù)量少，本研究主要對注釋到門水平及屬水平的物種進行統(tǒng)計分析。大鼠肝臟組織病理檢測已證實此實驗造模是成功的，兩兩比較結果表明，模型組與疏肝理脾低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而疏肝理脾高劑量組與疏肝理脾低劑量組間存在一定差異，但差異不顯著。而模型組與疏肝理脾高劑量組間在門水平上優(yōu)勢菌分別為厚壁桿菌、擬桿菌、變形菌和放線菌。門水平上兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），模型組與疏肝理脾高劑量組在屬水平共得到75個屬，豐度最高18個物屬分別為乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、示波螺旋藻屬、瘤胃球菌屬1、普氏菌屬1、未特指的毛螺菌科屬、普氏菌屬、梭菌屬、布勞特化菌屬、類桿菌屬、未特指的梭菌科屬、未特指的梭菌屬、未特指的類桿菌屬、未特指的瘤胃球菌科屬、未特指的消化鏈球菌科屬、異桿菌屬、未指定的腸桿菌科屬、其他等。在模型組和疏肝理脾高劑量組，這18個菌群占了所有菌群豐度的82.2%和90.1%以上。與模型組比較，乳酸球菌屬、考拉桿菌屬、脫鹵桿菌屬、羅氏菌屬、黏液桿菌屬、葡萄球菌屬、氣球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、昆蟲腸道菌屬、SMB53、瘤胃球菌屬、費氏刺骨魚菌屬、大腸桿菌屬、梭菌屬、未指明的梭菌科屬、霍爾德曼菌屬、“A”凝聚桿菌屬、小克里斯滕森氏菌等18種菌屬等僅在疏肝理脾高劑量組被檢測到，為疏肝理脾高劑量組所特有菌屬，而模型組缺如；與疏肝理脾高劑量組比較，有7個菌屬如脫硫弧菌屬、未特指的丹毒絲菌屬、念珠菌屬、腸球菌屬、耐鹽咸海鮮球菌屬、草酸桿菌屬、柱狀弧菌屬僅在模型組中被檢測到，為模型組所特有，而疏肝理脾高劑量組缺如；雖然這25個菌屬豐度低（每個菌屬所占比例<1%），但仍可提示與模型組比較，本研究中疏肝理脾高劑量組大鼠在屬水平上腸道微生物發(fā)生了明顯的變化。（見圖3）

圖2 各組大鼠腸道菌群OUTs分析圖

圖3 兩個分組在屬水平上的相對分布情況柱形圖（相對豐度前20的物種）

圖3示，模型組和疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群物種的組成存在明顯差異，優(yōu)勢菌群種類雖未發(fā)生變化，但所占的比例發(fā)生了變化。模型組的擬桿菌屬、梭菌屬、未指明的腸桿菌屬少于疏肝理脾高劑量組，而勞特氏菌屬、糞球菌屬則有所增多。這5種菌群的變化特征與以往報道的非酒精性脂肪肝炎的腸道菌群變化相符[8-9]。值得觀察的是疏肝理脾高劑量組大鼠的腸道菌群出現(xiàn)模型組所沒有的菌群，如乳酸球菌屬、考拉桿菌屬等18種菌屬，而模型組所具有的菌群如脫硫弧菌屬、未特指的丹毒絲菌屬等7種菌屬卻缺如，考慮為隨著藥物的使用，疏肝理脾高劑量組屬水平的菌群種類多于模型組，提示大鼠腸道菌群的豐度及豐富度明顯高于模型組。分析可能隨著藥物的治療作用，疏肝理脾高劑量組大鼠腸道潛在有益菌占據(jù)了優(yōu)勢，數(shù)量與種類較正常組增多，而致病菌卻失去了優(yōu)勢逐漸減少直至消失。

2.4 Beta多樣性分析Beta多樣性分析中Bray crutis距離表示樣本間豐富度差異，樣本之間距離越遠，樣本間物種豐富度差異越大；unweight unifrac距離反映樣本間物種的有無，樣本間距離相距越遠，提示物種間差異性越顯著。本研究通過分析Beta多樣性指數(shù)，比較組間菌群結構間的差異性，觀察NASH大鼠經(jīng)過高劑量疏肝理脾湯治療后腸道菌群結構的變化情況。結果提示模型組和疏肝理脾高劑量組Bray crutis及unweight unifrac均較遠且無交集，兩者在豐富度和物種組成方面有較大差異（見圖4）。圖5為基于Unweighted Unifrac距離進行的NMDS分析PERM ANOVA，經(jīng)過比較，疏肝理脾高劑量組大鼠與模型組大鼠間有顯著的差異，說明模型組和疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群間存在顯著差異。從圖中可以預估出疏肝理脾高劑量組對NASH大鼠有一定的治療作用，可能與大鼠腸道菌群改變相關。

圖4 模型組與疏肝理脾高劑量組Bray crutis（左）、unweight unifrac（右）圖

圖5 基于Unweighted Unifrac距離進行的NMDS分析PERMANOVA

2.5 組間差異顯著性分析 采用LEfSe（LDA Effect SiSe）法對模型組與疏肝理脾高劑量組組間進行特征性差異菌，分析屬水平上的差異菌，LDA>4提示差異有統(tǒng)計學意義，以LDA>4.8為標準篩選本次分析中的特征性差異菌。（見圖6）

圖6 模型組（A）和疏肝理脾高劑量組（B）大鼠糞便差異菌LDA評分圖圖6模型組（A）和疏肝理脾高劑量組（B）大鼠糞便差異菌LDA評分圖

圖7顯示模型組大鼠屬水平豐度較高的菌群依次為普氏菌科、毛螺菌科、草酸桿菌科、韋榮氏球菌科。疏肝理脾高劑量組大鼠屬水平豐度較高的菌群依次為擬桿菌科、土桿菌科、土桿菌、梭菌科、脫鹵桿菌科。上述分析提示模型組與疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群豐度存在明顯差異。

圖7 模型組（A）和疏肝理脾高劑量組（B）大鼠糞便差異菌進化分支圖

2.6 腸道菌群構成變化 采用熱圖分析對腸道菌群構成變化進行研究。選取總豐度排名前30的OTU繪制進化關系樹圖，同時結合OTU在各個分組的絕對豐度進行熱圖可視化展示。（見圖8）

圖8 系統(tǒng)發(fā)育進化樹及組間豐度分布熱圖

圖8顯示了不同菌群在不同部位的聚集情況。模型組與疏肝理脾高劑量組的OTU聚類更加直觀地表現(xiàn)了正常對照組腸道菌群結構變化：（1）毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普氏菌科（Prevotellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、韋榮氏菌科（Veillonellaceae）為模型組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌，在疏肝理脾高劑量組豐度下降；（2）梭菌科（Clostridaceae）、厚壁菌門（Peptostreptococcaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、S24-7、Erysipelotrichaceae為疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌，在模型組豐度下降，擬桿菌科、梭菌科為大腸中的優(yōu)勢菌在模型組豐度明顯降低；（3）S24-7、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、梭菌科（Clostridaceae）、Erysipelotrichaceae在結腸和糞便中豐度較多且相似，但在模型組已經(jīng)分散開來；（4）毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普氏菌科（Prevotellaceae）在模型組豐度明顯高于疏肝理脾高劑量組。

3 討 論

NAFLD已經(jīng)成為影響全球近三分之一成年人的全球公共衛(wèi)生問題。目前我國大陸地區(qū)NAFLD患病率為29.81%[10]，其中NASH占10%～20%，NASH患者10～15年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達15%～25%，而美國近10年因NASH進展接受肝移植登記累計增加97%[11-12]。然而，目前針對NAFLD防治，歐美指南推薦胰島素增敏劑，抗氧化劑E，以及他汀類藥物、貝特類藥物等，其多以改善NASH某一方面代謝性障礙癥狀為主，存在不能明顯改善肝臟脂質(zhì)沉積及炎癥反應等缺陷，若出現(xiàn)合并其他疾病時需要聯(lián)合用藥，加大了不良反應和副作用發(fā)生率[13-14]。因此研究有效阻斷NAFLD向NASH進展，探索NAFLD早期防治方法，具有十分重要的意義。

中醫(yī)學一般將NASH歸屬于“痞病”“肥胖病”等范疇，肝郁、脾虛、痰瘀為其基本病機，治療上多數(shù)采取疏肝、健脾、祛濕等治療方法[15-16]。病因上早期多見肝郁氣滯伴脾氣虛，脾虛益甚，日久肝脾腎俱虛，但無論是肝郁還是腎虛，都與脾密切相關，中醫(yī)強調(diào)肝、脾的關聯(lián)性及相互依賴、相互影響作用。如《素問·痹論篇》云：“飲食自倍，腸胃乃傷。”繆希雍于《本草經(jīng)疏》云：“飲啖過度，好食油面豬脂，濃厚膠固，以至脾氣不利，壅滯為患，皆痰所為”?！稖責峤?jīng)緯》謂：“過逸則脾滯，脾氣滯而少健運，則飲停濕聚矣”。飲食不節(jié)，勞逸失度，情志失調(diào)等所致脂肪肝，皆以脾虛為病理基礎，脾氣虧損貫穿并影響疾病的全過程?！案尾嵠ⅰ崩碚搧碓础督饏T要略》：“夫治未病者，見肝之病，知肝傳脾，當先實脾，四季脾旺不受邪，即勿補之。”肝屬木，脾屬土，它們在生理上互相依賴，病理上互相影響，肝病最易傳脾，故強調(diào)在治肝的同時，先調(diào)補脾氣，使脾臟正氣充實不受邪侵。故從中醫(yī)理論認識NASH，脾虛是其主要病機之一，健脾是NASH的一個重要治則。

以“肝病實脾”理論為指導的代表方疏肝理脾湯是我院治療慢性肝病經(jīng)典復方。疏肝理脾湯源于疏肝健脾名方柴芍六君子湯，由柴胡、茯苓、白芍、白術、砂仁、甘草等組成。方中柴胡疏肝行氣為君藥；茯苓健脾利濕，白芍養(yǎng)血柔肝為臣藥；白術健脾燥濕，砂仁溫中化濕，健脾消食為佐藥；甘草調(diào)和諸藥為使藥，共奏疏肝健脾之功效。我院多年臨床應用表明，其在改善各類慢性肝病炎癥和纖維化方面，尤其伴有腹脹、腹瀉、大便不調(diào)等脾虛癥狀臨床療效顯著。

“腸-肝軸”理論的提出發(fā)展了NAFLD的“多重打擊”學說，腸道菌群豐度被破壞，腸黏膜屏障功能穩(wěn)定性失衡，通透性增高，腸源性細菌/脂多糖（LPS）易位到腸外臟器，觸發(fā)NAFLD患者肝臟炎癥和肝損傷效應，以及腸道微生物群通過改變腸道菌群數(shù)量、比例和菌種性質(zhì)，可影響機體正常生理活動[17-19]。故重建腸道菌群穩(wěn)態(tài)成為當前阻止NASH持續(xù)進展的研究新熱點。腸道菌群與NASH關聯(lián)性研究實驗證實，NASH大鼠及患者腸道擬桿菌門降低，厚壁菌門降低，變形菌門、腸桿菌科增加，充分說明腸道菌群與NASH存在多途徑、多靶點密切關聯(lián)[20-22]。基于此，在中醫(yī)“肝病實脾”理論指導下，本課題組采用疏肝健脾法配伍的疏肝理脾湯干預NASH大鼠。研究發(fā)現(xiàn)疏肝理脾湯可通過上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表達，下調(diào)TLR4從而達到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善腸黏膜組織緊密連接，降低炎性因子表達等的作用[23]。

本研究通過16S rRNA高通量焦磷酸測序法對腸道微生物群落菌種組成、豐度、多樣性，以及菌群結構的差異特征進行特異性分析。結果發(fā)現(xiàn)疏肝理脾湯能明顯提高NASH大鼠腸道菌群中梭菌科、擬桿菌科比例，降低普氏菌科、毛螺菌科比例，表明疏肝理脾湯可通過調(diào)節(jié)腸道菌群構成比影響腸道菌群屬水平，恢復腸道微生態(tài)環(huán)境平衡。下一步我們將基于腸道微生物穩(wěn)態(tài)性結合代謝組學技術尋找出關鍵差異性代謝產(chǎn)物及可能關聯(lián)的關鍵代謝信號通路，為后期研究提供新靶點。