童培珍，潘禮業(yè)，索彩仙，何廣銘，何嘉瑩，李國(guó)衛(wèi)

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

2020年《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定苦楝皮為楝科植物川楝Melia toosendan Sied.et Zucc.或楝Melia azedarach L.的干燥樹皮和根皮，具有殺蟲、療癬等功效；臨床常用于蛔蟲病、蟯蟲病，蟲積腹痛，外治瘙癢疥癬[1]?？嚅に幉闹兄饕ㄩ亍⒖嚅?、苦楝萜酸甲酯等三萜類及兒茶素類化合物[2-5]。苦楝皮的主要有效成分是川楝素，具有驅(qū)蟲、抑制神經(jīng)遞質(zhì)、抗肉毒等多種生物活性[6]。研究表明川楝素能夠成功逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，可作為一種新型的PI3K抑制劑，用于逆轉(zhuǎn)乳腺癌的耐藥性[7]。川楝素能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞線粒體依賴性凋亡，故其在體內(nèi)外具有抗癌作用[8]。目前，已有文獻(xiàn)對(duì)不同部位及來(lái)源的苦楝皮藥材含量或指紋圖譜等方面進(jìn)行研究，但仍缺乏綜合性評(píng)價(jià)方法，未能全面評(píng)價(jià)苦楝皮藥材質(zhì)量[9-10]。近年來(lái)，采用質(zhì)量分析結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)已較為成熟，該模式能全面反映中藥材內(nèi)在質(zhì)量[11-12]。本研究采用HPLC-ELSD法對(duì)不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材特征圖譜進(jìn)行測(cè)定并比較，結(jié)合聚類分析和主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材進(jìn)行質(zhì)量分析，并同時(shí)測(cè)定川楝素含量，通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)，以期為苦楝皮藥材的綜合質(zhì)量控制提供參考。

1 材 料

1.1 儀器Waters ARC型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；Alltech 3000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)Alltech公司）；XP26型百萬(wàn)分之一電子天平、ME204E型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥 川楝素對(duì)照品（批號(hào)：111842-201804，含量：96.9%）、兒茶素（批號(hào)：110877-201604）、表兒茶素（批號(hào)：110878-200102）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇為分析純；乙腈、甲酸均為色譜純；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

苦楝皮藥材共12批，購(gòu)于廣東、廣西、湖北、安徽等地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定為楝科植物楝Melia azedarach L.的干燥樹皮，信息見表1。

表1 苦楝皮藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 苦楝皮藥材特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件Thermo Acclaim C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~15 min，8%~13%A；15~50 min，13%~55%A）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：漂移管溫度：110.0℃；載氣流量：2.7 L/min。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取川楝素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100μg的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，取出，放冷，補(bǔ)質(zhì)量，4 000 r/min離心10 min，精密移取上清液25 mL至蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解至5 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S1），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S1），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、5、10、15、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一藥材粉末（S1）約1.0 g，精密稱定，平行6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.5 樣品測(cè)定及分析

2.1.5.1 共有峰的確定 將得到的12批苦楝皮藥材特征圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件》進(jìn)行匹配和共有峰標(biāo)識(shí)，并生成對(duì)照?qǐng)D譜，見圖1~2。以7號(hào)峰為參照峰，12批藥材各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01%~0.24%范圍內(nèi)，說(shuō)明出峰時(shí)間較穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征性，可初步定為苦楝皮的指標(biāo)成分。經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)，共確定3個(gè)成分：5號(hào)峰（兒茶素），6號(hào)峰（表兒茶素），7號(hào)峰和8號(hào)峰（川楝素）。其中7號(hào)峰為其藥理藥效成分[3-4]，故選定為參照峰。12批苦楝皮相對(duì)峰面積RSD為6.80%~108.35%，其中S1~S6（廣東、廣西）6批苦楝皮藥材峰3~峰6的相對(duì)峰面積較S7~S12（安徽、湖北）低，說(shuō)明不同產(chǎn)地的藥材存在一定差異，結(jié)果見表2。

表2 苦楝皮藥材指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

圖1 12批苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜疊加圖

圖2 12批苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式

2.1.5.2 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 以生成的共有模式為對(duì)照指紋圖譜，12批樣品的相似度在0.720~0.998范圍內(nèi)，除了S2、S3外，其余批次藥材相似度均在0.900以上，說(shuō)明不同產(chǎn)地藥材整體質(zhì)量較為穩(wěn)定。（見表3）

表3 12批苦楝皮藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.5.3 聚類分析 將12批苦楝皮色譜峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件對(duì)4個(gè)產(chǎn)地藥材樣品進(jìn)行聚類分析，采用組間聯(lián)接法，選用歐氏距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，聚類分析可將12批苦楝皮主要分成2大類，Ⅰ類包括S1~S6、，即廣東與廣西樣品為一類；Ⅱ包括S7~S12即安徽亳州、湖北襄陽(yáng)樣品為一類?？傮w看來(lái)，地理位置相近的樣品可聚為一類，說(shuō)明質(zhì)量具有一定相似性，與相似度分析的評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。

圖3 聚類分析結(jié)果

2.1.5.4 共有峰主成分分析 對(duì)12批苦楝皮藥材共有峰進(jìn)行主成分分析，以8個(gè)共有峰峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率及綜合得分，對(duì)各產(chǎn)地的苦楝皮藥材進(jìn)行評(píng)價(jià)，見表4，碎石圖見圖4。由表4可知，前2個(gè)成分的特征值為5.120、2.106，均大于1，對(duì)總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)90.319%，可代表苦楝皮指紋圖譜共有峰的大部分信息，故選擇成分1、成分2作為第一、第二主成分。由碎石圖可見曲線存在一個(gè)明顯的拐點(diǎn)，說(shuō)明前2個(gè)主成分基本體現(xiàn)出不同產(chǎn)地不同批次苦楝皮藥材之間的相似度和差異性。初始因子載荷矩陣見表5，第一主成分載荷較高的有：峰3、峰4、峰5（兒茶素）、峰6（表兒茶素），第二主成分載荷較高僅有峰1（特征值大于0.8）。以第一、第二主成分為變量，得到投影圖，見圖5，前2名變量的權(quán)重值為0.966、0.947，對(duì)應(yīng)峰5（兒茶素）和峰6（表兒茶素）。與上述分析結(jié)果一致，即可判定峰5、6為評(píng)價(jià)各產(chǎn)地苦楝皮藥材質(zhì)量的重要因素。

表4 主成分特征值及方差

表5 主要因子載荷矩陣表

圖4 碎石圖

圖5 旋轉(zhuǎn)空間中的成分圖

2.1.5.5 綜合評(píng)價(jià) 針對(duì)第一、第二主成分按方差貢獻(xiàn)率加權(quán)計(jì)算綜合得分，結(jié)果見表6。綜合得分排名前3的樣品均為安徽省亳州市；排名前6的樣品中，安徽省亳州市3批、湖北省襄陽(yáng)市2批、廣東省廣州市1批；排名前9的樣品中，安徽省、湖北省、廣東省產(chǎn)地的樣品各3批。從綜合評(píng)價(jià)得分來(lái)說(shuō)，安徽省的苦楝皮藥材質(zhì)量較優(yōu)，湖北省次之，廣西省的苦楝皮藥材質(zhì)量相對(duì)較劣。

表6 綜合得分排序表

2.2 苦楝皮藥材含量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密稱定川楝素對(duì)照品2.156 mg，加入10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為川楝素貯備液，精密量取上述川楝素對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋為19.682、49.206、98.412、196.823、492.058μg/mL的 對(duì) 照 品 溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。川楝素線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y=1.653x+2.496，R2=0.999，結(jié)果表明在19.682~984.116μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的苦楝皮藥材粉（S1）約0.5 g，精密稱定，平行6份，加入與含量等量的對(duì)照品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果川楝素的平均回收率為103.65%，RSD為3.81%。（見表7）

表7 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.3 含量測(cè)定結(jié)果 精密吸取對(duì)照品溶液10、20μL及苦楝皮藥材供試品溶液20μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算川楝素含量；根據(jù)2020年《中華人民共和國(guó)藥典》“苦楝皮”項(xiàng)下測(cè)定苦楝皮藥材川楝素含量，結(jié)果見表8。由結(jié)果可知，HPLC-ELSD法測(cè)定苦楝皮藥材川楝素含量與UPLC-MS法測(cè)定含量偏差在5.0%以內(nèi)，說(shuō)明兩者測(cè)定苦楝皮中川楝素含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。總體來(lái)說(shuō)，廣東和廣西的苦楝皮藥材中川楝素含量（均值為0.122%）高于安徽省及湖北省（均值為0.054%），說(shuō)明不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材存在質(zhì)量差異。

表8 苦楝皮藥材含量測(cè)定結(jié)果（%）

3 討 論

川楝素為苦楝皮藥材的有效成分，其紫外特征吸收波長(zhǎng)為210 nm左右，屬于末端吸收，紫外檢測(cè)時(shí)基線波動(dòng)較大，所用流動(dòng)相為乙腈和甲酸水，甲酸紫外截止波長(zhǎng)為210 nm，故容易受到干擾。且前期研究發(fā)現(xiàn)苦楝皮藥材在210 nm波長(zhǎng)下，HPLC指紋圖譜色譜峰的個(gè)數(shù)少，不利于分析，而采用HPLCELSD法測(cè)定能有效解決上述問(wèn)題。

HPLC-ELSD法和UPLC-MS法測(cè)定苦楝皮中川楝素含量偏差在5.0%以內(nèi)，說(shuō)明兩者測(cè)定苦楝皮中川楝素含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。UPLC-MS法測(cè)定含量準(zhǔn)確度高，但其成本高于HPLC-ELSD法；HPLC-ELSD法不僅測(cè)定了苦楝皮中川楝素含量，也對(duì)苦楝皮藥材指紋圖譜進(jìn)行測(cè)定，但HPLC-ELSD法靈敏度低于UPLC-MS法，且無(wú)法進(jìn)行全波掃描，有可能存在色譜峰不純情況。

本研究建立了4個(gè)產(chǎn)地的苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了8個(gè)共有峰，通過(guò)化學(xué)指認(rèn)了其中的4個(gè)成分。對(duì)不同產(chǎn)地的苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜采用相似度、聚類和主成分進(jìn)行分析。12批次苦楝皮藥材的相似度范圍為0.720~0.998，除了廣東2批（S2、S3）小于0.900以外，其他各批次藥材均在0.900以上，說(shuō)明不同產(chǎn)地間的藥材具有良好的相似度。聚類分析結(jié)果將苦楝皮藥材分成兩大類，總體來(lái)看，廣東與廣西苦楝皮藥材質(zhì)量大體相近，安徽省與湖北省苦楝皮藥材質(zhì)量大體相近。廣東、廣西產(chǎn)地和安徽、湖北產(chǎn)地的苦楝皮藥材間存在較顯著差異，廣東、廣西產(chǎn)地苦楝皮藥材中川楝素整體含量高于安徽、湖北產(chǎn)地，而峰3~峰6相對(duì)峰面積遠(yuǎn)小于安徽、湖北產(chǎn)地，初步推斷地理位置及氣候?qū)е聫V東、廣西產(chǎn)地的苦楝皮藥材中色譜峰7（川楝素）峰面積較安徽、湖北產(chǎn)地大，峰3~峰6（兒茶素類）峰面積較安徽、湖北產(chǎn)地小?？嚅ぶ饕ㄩ亍⒖嚅拼純?nèi)酯等三萜類化合物和兒茶素等多酚類化合物。由于廣東省和廣西省地處低緯度地區(qū)，主要為亞熱帶季風(fēng)氣候，其特點(diǎn)為夏長(zhǎng)冬短，氣溫高，降水少，霜日少，日照多，雷暴頻繁，全年水熱同期，雨量充沛；而湖北省和安徽省地處中緯度，屬于季風(fēng)氣候，均具有南北過(guò)渡地帶的天氣氣候特征，氣候溫和，雨量適中，春寒多雨，秋高氣爽，四季分明，春秋多變。所以可能為地理氣候不同導(dǎo)致了苦楝皮藥材所含成分的差異。從綜合得分來(lái)說(shuō)，安徽省的苦楝皮藥材質(zhì)量較優(yōu)，湖北省次之，但苦楝皮主要用于治療蛔、蟯蟲病，蟲積和疥癬瘙癢，其活性成分為川楝素[13-14]，因此，結(jié)合藥理臨床作用和含量測(cè)定結(jié)果，認(rèn)為廣東、廣西產(chǎn)地的苦楝皮藥材質(zhì)量較優(yōu)。

本研究建立了苦楝皮藥材HPLC-ELSD指紋圖譜方法，并同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地苦楝皮藥材中川楝素含量，分析方法準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)，可為苦楝皮藥材質(zhì)量控制提供可靠的分析方法與參考依據(jù)。