馬婷婷，肖 凌，廖宗杰，吳劍鋒

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗學(xué)院，湖北 武漢 430065）

霧霾天氣作為現(xiàn)代社會進步發(fā)展的產(chǎn)物，其組成成分復(fù)雜多樣，且因地域季節(jié)而異，而細顆粒物PM2.5作為其重要的成分，嚴重威脅著人體健康。PM2.5的長時間暴露對呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]、心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病[3-4]等有較大影響。

PM2.5對呼吸系統(tǒng)損傷的機制主要包括炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫毒性及基因毒性[5]。其中PM2.5霧霾顆粒引起的肺部炎癥反應(yīng)最為直接，例如PM2.5進入肺泡被吞噬細胞吞噬可引起促炎癥因子的釋放，引發(fā)機體防御反應(yīng)。但在這個機體防御的過程中同時也直接或間接地造成組織和細胞的損害，促使多種呼吸道疾病的發(fā)生。

中醫(yī)針對霧霾，以預(yù)防為主，治法多為扶正祛邪、潤燥化濕、排毒清肺，中醫(yī)藥具有明顯優(yōu)勢[6]，且許多中藥復(fù)方對肺損傷有效[7]。霾黃金中藥茶主要由藥食同源中藥制成，成分包括羅漢果、蘆根、百合、甘草、薏苡仁、陳皮、余甘子、玉竹，具有清肺潤肺的功效，有望用于霧霾的防護，且在前期已經(jīng)進行了相關(guān)的急性毒理試驗[8]。

本實驗通過非損傷性氣管滴注進行SD大鼠的PM2.5霧霾顆粒染毒造模，對灌藥組進行霾黃金中藥茶溶液灌胃，最后主要通過檢測TNF-α、IgM、IgG、GLO（球蛋白）等指標(biāo)來探究霾黃金中藥茶對霧霾所致大鼠肺損傷模型的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8~9周齡SPF級SD雌性大鼠40只，購自湖北省實驗動物研究中心，動物合格證號：42000600036406，動物許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，將大鼠在適宜條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，體質(zhì)量為（199.8±5.9）g。實驗后水合氯醛麻醉后腹主動脈取血處死大鼠，且此實驗經(jīng)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 霾黃金（取自商品霾黃金伴侶茶，許可證編號：SC10642011801427）；PM2.5玻璃纖維濾膜2張（中國地質(zhì)大學(xué)提供，分別于2019年3月9日和2019年3月10日每天進行24 h采樣；平均溫度為12.6℃，累計體積為1 504 m3；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（貨號：MM-0180R）、大鼠免疫球蛋白G（IgG）ELISA試劑盒（貨號：MM-0064R）、大鼠免疫球蛋白M（IgM）ELISA試劑盒（貨號：MM-0065R）（江蘇菲亞）；球蛋白（GLO）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：180838）；氣管滴注管（自制，用1 mL注射器去掉針頭部分，套上尖端磨平的18 G留制針制成）。

1.3 主要儀器SCIENTZ-12型冷凍真空干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ3200型超聲震蕩儀（江蘇省昆山市淀海湖鎮(zhèn)）；MB-580型酶標(biāo)儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）。

1.4 造模與分組 制備PM2.5混懸液：將采樣好的PM2.5玻璃纖維濾膜2張（20 cm×25 cm），剪切成1 cm×1 cm大小的方塊，經(jīng)過無菌去離子水浸泡、超聲震蕩、過濾取濾液分裝于EP管內(nèi)，-80℃冰箱凍存3 h后置于真空冷凍干燥機冷凍干燥3 d，得干燥好的PM2.5無霾顆粒126 mg，將其溶于無菌去離子水中，配得10 mg/mL的混懸液。

將40只SPF級SD大鼠隨機分為空白組、對照組、模型組、灌藥組，每組10只?？紤]到暫時還沒有確定有效的防護霧霾的標(biāo)準(zhǔn)藥物，因此實驗未設(shè)置陽性對照組。在實驗的第1、3、5天，用7%的水合氯醛以0.5 mL/100 g的劑量麻醉大鼠，待大鼠完全麻醉后，采用無創(chuàng)性氣管滴注。將模型組與灌藥組大鼠置于木板上取仰臥位固定，將木板與桌面成約75°角立起后用剃毛機剃除大鼠喉頸部毛發(fā)，用鑷子提起大鼠的舌頭，借助聚光筆照射大鼠喉頸部來找到大鼠氣管，用自制滴注管滴注PM2.5混懸液，1 mL/kg，對照組大鼠滴注等量的無菌去離子水，空白組則不做處理。

1.5 實驗給藥 配置霾黃金中藥茶溶液：人一日喝一袋（1.5g），實驗中大鼠劑量設(shè)為人的20倍，此劑量在前期急性毒理試驗[8]中的安全劑量范圍內(nèi)，且為預(yù)實驗中探索的合適劑量，參考徐叔云主編的《藥理實驗方法學(xué)》的體表面積換算法，計算得大鼠劑量為2.7 g/kg。大鼠每次的灌胃量為2 mL，大鼠體質(zhì)量約200 g，所以每次配置270 mg/mL的霾黃金中藥茶溶液。灌藥組大鼠從實驗第1天起每天用270 mg/mL霾黃金中藥茶溶液灌胃2 mL，連續(xù)10 d，對照組和模型組則灌胃等量去離子水，空白組不做處理。

1.6 觀察指標(biāo) 第11天，用7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉大鼠，打開大鼠腹腔用加抗凝劑的真空采血管取大鼠腹主動脈血，離心分離血漿；打開大鼠胸腔分離出完整肺組織和氣管，用止血鉗夾住氣管和左支氣管，在右支氣管上方用小剪子切一個小口，使用抽取2 mL預(yù)冷PBS溶液自制滴注管插入，用細線系緊，注入右肺后停留30 s后回抽得到右肺肺泡灌洗液，離心取上清；用試劑盒測定每組大鼠血漿與肺泡灌洗液中的TNF-α、IgG、IgM和GLO。將大鼠左肺置于組織固定液12 h后，石蠟包埋切片，HE染色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，各組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織大體觀察 空白組和對照組大鼠肺組織呈現(xiàn)正常血肉色，滑嫩柔軟且有彈性，無明顯異?，F(xiàn)象；模型組大鼠肺組織則相對變硬，暗色存于表面，且還存在較大的黑色斑塊；灌藥組大鼠肺組織雖也呈淺暗紅色，其表面卻存在部分白色斑塊及較為細小的血色小斑點，病變程度低于模型組。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織大體形態(tài)

2.2 肺組織病理學(xué) 與空白組和對照組比較，模型組可見肺泡腔縮小，肺泡局部斷裂，肺泡間隔增寬，且有大量的炎性細胞浸潤；與模型組比較，灌藥組損傷情況較輕，炎細胞浸潤較為減輕，肺毛細血管結(jié)構(gòu)較為完整，但仍可見少量出血現(xiàn)象。（見圖2）

圖2 各組大鼠肺組織石蠟切片圖（HE，×400）

2.3各組大鼠肺泡灌洗液和血漿中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比較 對照組大鼠肺泡灌洗液中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；模型組大鼠肺泡灌洗液中IgM、TNF-α、GLO含量明顯高于對照組（P<0.05）；灌藥組大鼠肺泡灌洗液中IgM、TNF-α、GLO含量明顯低于模型組（P<0.05）；各組大鼠肺泡灌洗液中IgG含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比較（±s）

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比較（±s）

注：與空白組比較，aP>0.05；與對照組比較，bP<0.05；與模型組比較，cP<0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）IgM（μg/mL）IgG（μg/mL）TNF-α（pg/mL）GLO（g/L）空白組 10 0 1 348.9±171.3 481.2±53.1 178.29±60.0 11.42±4.07對照組 10 0 1 280.9±155.4a 486.0±53.3a 197.82±46.4a 10.16±3.44a模型組 10 0 1 557.1±130.5b 513.4±39.9 319.47±56.7b 23.67±5.31b灌藥組 10 2.7 1 319.1±83.7c 511.4±39.2 203.95±45.1c 16.36±3.87c

對照組大鼠血漿中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；模型組和灌藥組大鼠血漿中IgM、TNF-α含量明顯高于對照組（P<0.05），灌藥組大鼠血漿中IgM、TNF-α含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；各組大鼠血漿中IgG、GLO含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血漿中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比較（±s）

表2 各組大鼠血漿中IgM、IgG、TNF-α、GLO含量比較（±s）

注：與空白組比較，aP>0.05；與對照組比較，bP<0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）IgM（μg/mL）IgG（μg/mL）TNF-α（pg/mL）GLO（g/L）空白組 10 0 1 127.6±91.2 392.6±33.5 503.50±44.2 39.23±9.62對照組 10 0 1 130.6±61.1a 411.0±23.4a 506.58±61.3a 39.01±9.47a模型組 10 0 1 570.3±137.0b 418.0±20.6 707.93±65.4b 42.84±7.48灌藥組 10 2.7 1 468.7±193.8b 413.4±15.3 643.48±71.0b 40.22±6.32

3 討 論

PM2.5作為空氣質(zhì)量監(jiān)測的重要指標(biāo)，對人類呼吸系統(tǒng)的損傷尤為直接與嚴重，大量流行病學(xué)研究顯示PM2.5長期暴露會明顯增加肺部疾病的發(fā)病風(fēng)險，包括肺炎、哮喘、COPD、塵肺、肺癌、肺纖維化和間皮瘤等[9]。在中醫(yī)學(xué)上，霧霾集燥、濕、毒邪于一體，治療上強調(diào)“未病先防，既病防變”，辨證論治[10]，霧霾引起的肺部炎癥可用清肺、潤肺的中藥，如羅漢果、玉竹、蘆根、余甘子、百合、陳皮等具有抗菌及調(diào)節(jié)免疫的作用。甘草具有解毒功效。以上中藥結(jié)合健脾中藥如陳皮、薏苡仁等組合而成的中藥茶可用于霧霾的防護研究。

本實驗選用SD大鼠，通過非損傷性氣管滴注的方法來進行PM2.5霧霾顆粒染毒處理，從實驗結(jié)果中可以看出，對照組與空白組比較，無明顯差異，說明實驗操作對大鼠無明顯影響，而模型組無論是大鼠肺組織大體觀察、HE染色鏡下觀察，還是肺泡灌洗液和血漿中的IgM、TNF-α含量及肺泡灌洗液中GLO含量，與對照組比較，均有明顯的差異，表明PM2.5霧霾顆粒會引起大鼠肺部病理損傷，且讓肺泡灌洗液和血漿中TNF-α和IgM以及肺泡灌洗液中的GLO分泌增加，而IgG并沒有明顯變化。

TNF-α是一類主要由活化單核巨噬細胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)的起始階段釋放的促炎性細胞因子，PM2.5霧霾顆粒引起其分泌增加，這與李美珍等[11]研究結(jié)果一致。PM2.5的直徑較小，可避開人體內(nèi)纖毛的濾過作用，隨著呼吸而直接進入到呼吸道深部，與肺內(nèi)的細胞進行直接的接觸，引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在肺部疾病中起關(guān)鍵作用[12]。而PM2.5引起機體炎癥反應(yīng)機制復(fù)雜，與支氣管上皮細胞[13]、肺巨噬細胞[14-15]、血管內(nèi)皮細胞[16]等相關(guān)，其導(dǎo)致炎癥因子（如TNF-α等）的異常分泌。此外，眾多細胞因子還參與B細胞的活化，促使體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織和器官的免疫損傷。

PM2.5霧霾顆粒除了導(dǎo)致細胞因子的異常分泌外，還可導(dǎo)致免疫球蛋白的變化。PM2.5霧霾顆?？蓪?dǎo)致SIgA[17]上升，以及哮喘患者IgE[18]的分泌增加。ZHAO J等[19]在研究交警暴露于PM2.5對全身免疫和炎癥反應(yīng)的生物學(xué)影響時發(fā)現(xiàn)，暴露于PM2.5后IgM、IgG和IgE增加且IgA和CD8 T細胞減少，這表明體液免疫被激活但是細胞免疫可能被抑制。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM2.5霧霾顆粒可引起大鼠肺損傷模型肺泡灌洗液中球蛋白的增高，IgM分泌增加，而IgG并沒有明顯變化，原因可能是短期內(nèi)PM2.5霧霾顆粒的暴露引起了早期體液免疫應(yīng)答，以IgM升高為主。

此外，LENDAK D F等[20]認為TNF-α超家族成員是B細胞穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，其中B細胞活化因子（BAFF）是免疫球蛋白產(chǎn)生的主要誘導(dǎo)劑，其與IgM濃度呈正相關(guān)。本實驗結(jié)果表明，與模型組比較，灌藥組大鼠肺組織損傷較模型組輕微，病理切片中炎細胞浸潤、肺泡間隔增寬等現(xiàn)象明顯改善，且肺泡灌洗液中的IgM、TNF-α含量明顯降低，說明霾黃金中藥茶可在一定程度上緩解PM2.5引起的免疫性炎癥因子的分泌和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，其機制可能是降低TNF-α，調(diào)節(jié)BAFF，降低IgM，從而下調(diào)體液免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)。在接下來的實驗中將進一步探討具體機制，包括PM2.5對BAFF因子水平的影響，以及上升的IgM主要來源。