邢蕾，劉仡，劉杰，李品鶴，胡希，徐恒，劉路路，周文，易鎮(zhèn)邪

1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南省長沙市 410128；

2 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長城雪茄煙廠，四川省什邡市 618400

微生物生長的葉表面稱為葉際，葉際是植物葉面組成的獨立微生境[1-2]。生活在葉際的細菌、真菌、藻類等微生物稱為葉際微生物。葉際由于長時間接受太陽紫外線照射、遭遇單日溫濕度劇烈波動，降水的沖刷，加之能被利用的養(yǎng)分又極少，長期以來被認(rèn)為是一個不利于微生物定殖的生境。也有研究發(fā)現(xiàn)，葉際定殖著豐富的微生物種群，并具有多種生物學(xué)功能[3-5]。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)葉際存在數(shù)量龐大的微生物，每平方厘米鮮葉表面微生物數(shù)量高達106～107個[6-7]，具有提高植物的抗病[6-7]、抗蟲[8-9]、固氮[10-11]、分解有毒有害物質(zhì)[12]、產(chǎn)生激素促進植物生長等多種生態(tài)功能。

雪茄香氣濃郁、吸味豐滿，國內(nèi)雪茄市場日趨成熟，雪茄正從炫耀性消費向需求性消費轉(zhuǎn)變，2013年至今雪茄銷量每年均保持較快的增長速度。據(jù)統(tǒng)計，2020 年國產(chǎn)手工雪茄累計實現(xiàn)銷售1224 萬支，同比增長121%。優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉是雪茄工業(yè)的命脈，其質(zhì)量直接決定雪茄品質(zhì)的高低[13]。微生物在煙葉原料生產(chǎn)過程中扮演著重要角色[14]。研究表明微生物能促進煙葉發(fā)酵、縮短發(fā)酵周期，改善煙氣勁頭和刺激性，提高香氣質(zhì)和香氣量，提升煙葉品質(zhì)。在煙葉調(diào)制期間，煙葉的霉?fàn)€和TSNAs 的積累與微生物有著重要的關(guān)聯(lián)。相較于烤煙采收后的高溫烘烤，雪茄煙葉采收后的調(diào)制主要通過晾曬和自然發(fā)酵完成，調(diào)制相對溫和。大田成熟期葉際真菌能更好保留至調(diào)制和發(fā)酵階段，并發(fā)揮重要功能。真菌既是葉際微生物的重要類群，又參與煙葉品質(zhì)的形成。但迄今為止，雪茄煙葉大田成熟期葉際真菌菌群特征及其形成機理卻知之甚少。深入了解生態(tài)環(huán)境、基因型與葉際真菌群落結(jié)構(gòu)的內(nèi)在聯(lián)系對雪茄種植、品質(zhì)調(diào)控都有重要意義。因此，本研究以成熟期雪茄煙中部葉為材料，采用高通量測序技術(shù)研究生態(tài)環(huán)境和基因型對葉際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示雪茄煙葉際真菌與生態(tài)環(huán)境和基因型的內(nèi)在聯(lián)系，以期為發(fā)掘和利用葉際真菌資源提供科學(xué)依據(jù)，為優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地點位于海南儋州光村（GC.）和五指山（WZS.）雪茄種植基地。儋州光村的土壤有機質(zhì)11.84 g/kg，全氮0.53 g/kg，全磷0.45 g/kg，全鉀1.16 g/kg，水解氮76.66 mg/kg，有效磷32.55 mg/kg，速效鉀48.15 mg/kg。五指山的土壤有機質(zhì)23.33 g/kg，全氮1.48 g/kg，全磷1.32 g/kg，全鉀25.85 g/kg，水解氮123.37 mg/kg，有效磷35.64 mg/kg，速效鉀93.34 mg/kg。

1.2 栽培方法

選擇3 個不同基因型且抗病性和株型較一致的雪茄茄芯品種海研101（M1）、海研201（M2）、海研109（M3），試驗地選擇產(chǎn)量適中、土壤肥力中等且均勻、無病蟲害的煙田。供試肥料為煙草專用復(fù)合肥和專用追肥，復(fù)合肥60%作基肥大窩圈施，剩余40%肥料在移栽后20 d 一次性追施。施氮量180 kg/hm2，養(yǎng)分比例為N: P2O5: K2O= 1: 1: 3。每個處理設(shè)3 個小區(qū)，每個小區(qū)90 m2，株行距40 cm×100 cm，其他田間管理措施按照當(dāng)?shù)胤N植技術(shù)進行。

1.3 樣品采集

于2019 年4 月17 日雪茄煙葉成熟期采集完整、無病蟲害的中部煙葉，每個小區(qū)隨機選18 株，每6株的中部煙葉3 片作為一個樣品，每個樣品100 g。用滅菌鑷子將葉片裝入滅菌的封口袋，置于4℃ 冰盒暫存，帶回實驗室后儲存于4℃冰箱中。

1.4 葉際真菌總 DNA 提取與測序

在無菌臺上將采集的中部葉樣品剪成1 cm 左右的小葉片，按樣品混合均勻后稱取10.00 g 葉片，置于裝有無菌水的三角瓶中室溫下?lián)u床上振蕩 30 min，200 r/min，結(jié)束后40 kHz 超聲處理15 min。無菌操作下，采用真空抽濾裝置將微生物收集于0.22 μm 濾膜上。參考Griffith 的方法，采用CTAB 法提取葉際真菌總DNA。利用Illumina NovaSeq 測序平臺對真菌18S rRNA 基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-1F 進行PCR 擴增，引物序列為ITS1-1F-F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS1-1F-R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC[15-17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用FLASH V1.2.7對每個樣本的reads進行拼接，運用QIIME V1.9.1對數(shù)據(jù)進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，用Uparse v7.0.1001 （http://www.drive5.com/uparse/）對所有樣本的全部 Effective Tags進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，用Qiime軟件（Version 1.9.1）中的blast方法（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）與Unit(v8.2)數(shù)據(jù)庫（https://unite.ut.ee/）進行物種注釋。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree 指數(shù)，使用R軟件（Version 3.62）繪制稀釋曲線，并使用R軟件進行Alpha多樣性分析；運用SPSS22.0分析生態(tài)環(huán)境、基因型及其交互作用與葉際真菌的影響[18-20]。

2 結(jié)果

2.1 OTU 聚類及物種注解

由圖1 可知，各樣品的測序深度為40000 時趨于飽和，稀釋曲線趨于平緩，已涵蓋樣品中的絕大多數(shù)物種，增加測序數(shù)據(jù)亦不能再找到更多的OTU。因此，本次試驗的測序深度已覆蓋各樣品中的絕大多數(shù)物種，測序數(shù)據(jù)量可以表征雪茄煙葉葉際真菌的特征和多樣性。由圖2 可知，6 個煙葉樣品中共有1473 個特異性O(shè)TU，172 個共有OTU，占總數(shù)的11.68%，且光村生態(tài)區(qū)的OTU 數(shù)量是五指山生態(tài)區(qū)的3.07 倍。三個雪茄基因型中以M3 的OTU 數(shù)量最高。三種基因型的雪茄煙在光村和五指山種植，同一基因型不同生態(tài)環(huán)境的煙葉樣本OTU 數(shù)量表現(xiàn)明顯的差異，GC.M1 與WZS.M1 具有345 個共有OTU，GC.M1 有319 個特異性O(shè)TU，WZS.M1 有242 個特異性O(shè)TU；GC.M2 與WZS.M2 有349 個共有OTU，GC.M2 有412 個 特 異 性O(shè)TU，WZS.M2 有287 個特 異 性O(shè)TU；GC.M3 與WZS.M3 具 有426 個 共 有OTU，GC.M3 有1024 個 特 異 性O(shè)TU，WZS.M3 的特異性O(shè)TU 為280 個。

圖1 OTUs 稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curve of OTUs

圖2 基于OTU 的Venn 圖Fig. 2 Venn diagram based on OTUs

2.2 葉際真菌多樣性比較

如表1所示，各處理的葉際真菌測序文庫構(gòu)建良好，覆蓋度均達到 99% 以上。測序結(jié)果具有較好的代表性。Alpha多樣性分析表明Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)范圍分別在2.43～4.20、0.54～0.85、316.96～610.66、313.67～613.52。方差分析表明GC.M3的Shannon、Chao1和ACE指數(shù)顯著高于WZS.M1～WZS.M3（P<0.05），Simpson指數(shù)極顯著高于WZS.M1～WZS.M3（P<0.01）。GC.M3的Chao1和ACE指數(shù)顯著高于GC.M1（P<0.05）。

表1 葉際真菌Alpha 多樣性指數(shù)Tab. 1 Alpha diversity indices of phyllospheric fungi ( mean±SD, n = 3)

2.3 葉際真菌菌落組成

由圖3（A）可知，雪茄煙中10個優(yōu)勢葉際真菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、羅 茲 菌 門（Rozellomycota）、 球 囊 菌 門（Glomeromycota）、捕蟲霉門 （Zoopagomycota）、油 壺 菌 門（Olpidiomycota） 和 梳 霉 門（Kickxellomycota ） 。各樣品中隸屬于上述10個優(yōu)勢門的真菌OTU量之和均超過總 OTU 的97%。10個優(yōu)勢門中，各煙葉樣品均以子囊菌門（Ascomycota）含量最高，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）次之，其OTU數(shù)量占總OTU數(shù)量分別為53.85%～91.69%，19.99%～44.46%。

由圖3（B）可知，1 0 個優(yōu)勢葉際真菌屬分別是枝孢屬（Cladosporium），桑帕氏酵母菌屬（Sampaiozyma）、尾孢菌屬（Cercospora）、鏈格孢屬（Alternaria）、被孢霉屬（Mortierella）、紅菇屬（Russula）、黑團孢屬（Periconia）、子囊菌屬（Archaeorhizomyces）、赤霉屬（Gibberella）和假尾孢屬（Pseudocercospora）。GC.M1和GC.M2的上述10個優(yōu)勢葉際真菌屬OTU數(shù)量均超過總OTU的89%，GC.M3的OTU超過82%，WZS.M1～WZS.M3的OTU均超過93%。

圖3 葉片真菌群落中10 個優(yōu)勢門（A）和屬（B）的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of 10 dominant genera in phyllosphere fungi at the phylum (A) and genus (B) level

2.4 兩生態(tài)區(qū)不同生育期氣候比較分析

光村海拔高度為51.6 m，五指山為海南省海拔最高地，為154 m。本研究利用小氣候收集器，記錄了大田生長期的氣候變化。由表2可知光村和五指山的溫度相差較小，但濕度有明顯的差異，在成熟期兩地溫度均達到大田生長期最高；整個大田生長期光村的濕度均大于五指山；五指山降水總量高于光村，還苗期、伸根期、旺長期兩地降水總量差距不大，但在成熟期，五指山降水總量為光村的1.57倍；還苗期、伸根期、成熟期，五指山平均光合有效輻射量均高于光村，旺長期則是光村略高于五指山。

表2 兩生態(tài)區(qū)不同生育期氣候差異Tab. 2 Climate differences in different growth stages of two ecological regions

2.5 葉際真菌群落變化主要影響因素分析

由表3可知，雪茄煙成熟期葉際真菌群落中屬水平受生態(tài)環(huán)境、基因型及其二者交互作用的顯著影響。方差分析表明枝孢屬相對豐度受生態(tài)環(huán)境和基因型的影響分別達到極顯著水平（P<0.01）和顯著水平（P<0.05）；桑帕氏酵母菌屬受生態(tài)環(huán)境的影響達到極顯著水平（P<0.01），受生態(tài)生境-基因型交互作用影響達到顯著水平（P<0.05）；赤霉屬和假尾孢屬受生態(tài)環(huán)境的影響達到極顯著水平（P<0.01）。如圖4所示，基于weighted Unifrac距離的PCoA分析表明第一主成分和第二主成分分別解釋了77.30%和15.42%的變異；五指山和儋州光村兩個生態(tài)區(qū)的葉際真菌能較好的分離。因此，生態(tài)環(huán)境對葉際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響更為顯著。

表3 葉際真菌群落結(jié)構(gòu)影響因素的多因子方差分析Tab. 3 Multi-factor variance analysis of the factors influencing phyllosphere fungal community structure

圖4 葉片真菌PCoA 分析圖Fig. 4 PCoA plots of phyllospheric fungi

3 討論

文章物種群落組成的結(jié)果表明，三個不同基因型的雪茄煙葉際真菌物種的組成較為豐富。在門水平上，三個不同基因型的雪茄煙葉的優(yōu)勢菌門主要為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota），有研究指出子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的菌群在真菌界中占比高至98%[21]，且子囊菌門物種高于擔(dān)子菌門2倍以上[22]，本文的研究結(jié)果與前人結(jié)果一致；在屬水平上，其優(yōu)勢菌屬主要為：枝孢屬（Cladosporium），桑帕氏酵母菌屬（Sampaiozyma）、尾孢菌屬（Cercospora）、鏈格孢屬（Alternaria）。枝孢屬（Cladosporium）是一種致腐真菌，能快速生長，誘發(fā)腐爛病[23]，鏈格孢屬（Alternaria）能通過破壞植物的細胞壁、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方式引發(fā)煙草赤星病[24]，尾孢菌屬（Cercospora）也是一種病原菌屬，能導(dǎo)致煙草蛙眼病，該病在煙區(qū)為普遍發(fā)生。無論是在門水平還是屬水平上，相同基因型的樣本在不同生態(tài)環(huán)境的表現(xiàn)差異較大，這可能是受生態(tài)環(huán)境的影響造成的。

葉際定殖著大量細菌、真菌、和少量放線菌，具有固氮、抗病、促生長等多種生態(tài)功能，與植物有著非常緊密的關(guān)系[9]。本研究發(fā)現(xiàn)成熟期雪茄煙葉葉際真菌群落多樣性Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)儋州光村（GC.）整體高于五指山（WZS.），說明生態(tài)環(huán)境與雪茄煙葉葉際真菌群落結(jié)構(gòu)有著明顯的相關(guān)性。研究還發(fā)現(xiàn)枝孢屬（Cladosporium）、桑帕氏酵母菌屬（Sampaiozyma）、赤霉屬（Gibberella）和假尾孢屬（Pseudocercospora）受生態(tài)環(huán)境的影響達極顯著水平（P<0.01）。說明雪茄煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)環(huán)境的相關(guān)性較之與基因型的相關(guān)性更加明顯，PCoA和方差分析表明生態(tài)環(huán)境對葉際真菌群落影響高于基因型。

葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響因素是多方面的。既受宏觀如降水、太陽輻射、晝夜溫差等氣候特征的影響，也受微觀尺度如植物葉位、葉脈、角質(zhì)層厚度及化學(xué)成分、葉面附屬物及類型等的影響[21-23]，如Botella等研究表明水分、太陽輻射是地中海松（Pinus halepensis）葉際真菌的主要影響因子[24]。這是因為植物葉面的微環(huán)境相對惡劣，養(yǎng)分相對匱乏，葉際微生物本就難以定殖，降雨量的增加加劇了對葉際微生物的沖刷，太陽輻射增強會導(dǎo)致葉片溫度升高和紫外線增加，都不利于葉際微生物的定殖[25]。本研究發(fā)現(xiàn)光村生態(tài)區(qū)的煙葉樣本真菌OTU數(shù)量是五指山的3.07倍，而光村大田生育期的降雨總量為89 mm，五指山大田生育期的降雨總量達132 mm，大田生育期間五指山的降雨總量和平均光合有效輻射均高于儋州光村，雨水的沖刷和紫外線的照射都會使葉面微生物減少，由此分析降雨量和平均光合有效輻射可能是真菌結(jié)構(gòu)差異的重要原因，這與Botella等人的研究結(jié)果相一致。土壤環(huán)境、溫度、濕度等因素都能對微生物的群落結(jié)構(gòu)造成影響[30]，本研究發(fā)現(xiàn)雪茄煙葉葉際優(yōu)勢真菌子囊菌門和擔(dān)子菌門，這兩類真菌在土壤中也大量存在，土壤微生物能遷移至葉際[31]，由此推斷五指山樣本的子囊菌門均高于光村可能是因為五指山土壤中子囊菌門數(shù)量遠高于光村。

基因型也是葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)的重要影響因素，部分葉際真菌對植物種類有定殖特異性[32-33]。Baffi等研究表明橄欖葉際真菌主要包括曲霉菌屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和根毛霉菌屬（Rhizomucor）等7屬。高旭暉等研究表明茶樹葉際真菌主要是鏈格孢屬 （Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、尾孢屬（Cercospora）等真菌[34]。不同基因型的植株通過介導(dǎo)葉片結(jié)構(gòu)如氣孔導(dǎo)度、葉片厚度，化學(xué)成分，分泌物而影響葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)[35-36]。如研究表明不同基因型烤煙的葉片結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、揮發(fā)性香氣物質(zhì)以及腺毛主要分泌物都有顯著差異[13,37]。本研究表明枝孢屬（Cladosporium）受基因型影響達到顯著水平（P<0.05）。

本文對雪茄煙葉成熟期的真菌群落結(jié)構(gòu)與基因型和生態(tài)環(huán)境的關(guān)系進行了詳細的闡述，下一步將對真菌對雪茄煙葉晾制以及發(fā)酵的影響進行研究，并結(jié)合雪茄煙葉感官品質(zhì)進行分析，以探索雪茄煙葉品質(zhì)形成機理。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)研究了不同生態(tài)環(huán)境和不同基因型對大田成熟期雪茄煙葉葉際真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。研究表明：（1）儋州光村雪茄煙葉葉際真菌群落的多樣性高于五指山；（2）三種不同基因型的雪茄煙葉優(yōu)勢門主要包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門、毛霉門、壺菌門、羅茲菌門、球囊菌門、捕蟲霉門、油壺菌門和梳霉門，優(yōu)勢屬主要包括枝孢屬，桑帕氏酵母菌屬、尾孢菌屬、鏈格孢屬、被孢霉屬、紅菇屬、黑團孢屬、子囊菌屬、赤霉屬和假尾孢屬；（3）生態(tài)環(huán)境、基因型以及二者的交互作用均能對雪茄煙葉葉際真菌群落結(jié)構(gòu)造成影響，但生態(tài)環(huán)境對其影響最大。