張孝廉，張吉順*，賈蒙驁，張莉莉，曹領(lǐng)改

1 貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號 550081；

2 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025

煙草白粉病俗稱“上灰”、“下霜”、“上硝”，感病煙葉烘烤后薄如紙，色暗銹褐色，喪失經(jīng)濟(jì)價值，散葉堆放和鮮煙裝炕階段白粉病菌均可侵染煙葉[1]。目前，煙草白粉病的防治主要以化學(xué)防治為主，極易造成農(nóng)藥殘留，是當(dāng)前煙葉農(nóng)殘超標(biāo)的主要因素之一。培育抗病品種是防治煙草白粉病最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法，因此，白粉病抗性相關(guān)研究得到了廣泛的關(guān)注，并取得了重要進(jìn)展。小麥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了50 多個Pm（Powdery mildew）抗性位點[2-5]，擬南芥中也分離到許多涉及不同途徑的白粉病抗性基因[6-8]。其中，mlo（Mildew resistance locus O）基因最先在大麥中[9]被鑒定，由于mlo介導(dǎo)的白粉病抗性具有廣譜、持久的優(yōu)點，在小麥等作物中開展了廣泛的研究和利用，并取得顯著效果。在番茄[10]，辣椒[11]，煙草[12]等茄科植物中也陸續(xù)報道了與白粉病抗性相關(guān)的MLO同源基因。通過對茄科植物中白粉病相關(guān)MLO基因鑒定和功能驗證，明確了煙草NtMLO1基因可以互補(bǔ)番茄mlo突變體的感病性[12]。NtMLO1和NtMLO2基因突變導(dǎo)致了日本晾曬煙品種Kokubu 的白粉病抗性[13-14]。

煙草白粉病抗病育種中最廣泛而成功利用的是Kokubu 抗性，而國內(nèi)品種抗煙草白粉病育種也取得了一定的進(jìn)展，孟坤等[15]用不同的白粉病菌對21 個煙草品種進(jìn)行接種鑒定，發(fā)現(xiàn)對兩個菌種均表現(xiàn)免疫的是塘蓬，表現(xiàn)高抗的為NC89，高感品種為中煙90 和CF203。李華麗等[16]以臺煙7 號和白肋21 作為雜交親本，后代自交衍生的127 個F2 和F2:3 家系為材料，檢測到1 個煙草白粉病加性QTL，貢獻(xiàn)率為11.63%。牟建英等[17]利用2317 對SSR 引物對煙草白粉病抗性基因進(jìn)行QTL 定位，檢測到1 個白粉病抗性位點，與SSR 引物52725 緊密連鎖，遺傳距離為1.01cM，其加性效應(yīng)為-14.38，貢獻(xiàn)率為21.02%。

本文通過對抗感分離群體進(jìn)行白粉病抗病鑒定，開發(fā)與白粉病抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，旨在為國內(nèi)煙草白粉病抗源的高效利用及抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料種植和接種鑒定

本研究中使用的煙草材料見表1，由貴州省煙草科學(xué)研究院種質(zhì)資源庫保存。統(tǒng)一采用漂浮育苗法育苗，置于光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置8 h/16 h 光照/黑暗，25℃/23℃，80%濕度。于6 ～8 葉期進(jìn)行白粉病接種實驗，取新鮮的感白粉病煙草葉片，將葉片上新鮮的白粉病孢子均勻抖落在待接種煙苗上，每個材料接種煙苗30 株，置于黑暗中暗培養(yǎng)2 d 后恢復(fù)8 h/16 h光照/黑暗光周期，25℃/23℃，80%濕度，接種后10 d 調(diào)查發(fā)病情況。按照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 23222—2008 煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》中對白粉病發(fā)病等級的劃分，鑒定煙草材料對白粉病的抗性。

表1 供試煙草品種Tab. 1 Tobacco germplasm resource used in this research

1.2 DNA 提取與NtMLO 基因突變區(qū)的克隆

根據(jù)已報道NtMLO1和NtMLO2的基因序列[14]設(shè)計引物MLO1-F/MLO1-R，MLO2-F/MLO2-R（表2）擴(kuò)增突變區(qū)序列。以表1 中材料的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收送到上海生工公司進(jìn)行基因測序。

1.3 分子標(biāo)記設(shè)計與篩選

根據(jù)抗病和感病材料間NtMLO1和NtMLO2的基因序列差異，在差異位點設(shè)計引物（表2）。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：50 ng/μL DNA 模板1 μL，2×Go Taq Mix 10 μL，100 μmol/L 正 反 向 引 物 各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

表2 引物序列信息Tab. 2 The sequence information of primers

2 結(jié)果分析

2.1 不同資源的抗性鑒定

選取8 份材料進(jìn)行抗性鑒定，按照國標(biāo)進(jìn)行調(diào)查和統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)臺煙7 號和KE1 表現(xiàn)出高抗白粉病，抗病等級為1 級，NC82 等材料表現(xiàn)為高感白粉病。

表3 不同煙草品種對白粉病抗性統(tǒng)計Tab. 3 The powdery mildew resistance of different tobacco varieties

圖1 不同煙草品種對白粉病抗性的鑒定Fig. 1 Identification of powdery mildew resistance for different tobacco varieties

2.2 分離群體抗性鑒定及遺傳分析

對抗病材料臺煙7 號和感病材料K326 構(gòu)建的960 個F2 單株及642 個BC1F1 單株開展了苗期白粉病抗性鑒定，結(jié)果表明（表4）F1 全部表現(xiàn)為感病，F(xiàn)2 群體的感抗分離比符合15:1，BC1F1 群體的抗感分離比為1:3，表明臺煙7 號的抗性符合雙基因隱性遺傳規(guī)律。

表4 分離群體抗病/感病表型調(diào)查Tab. 4 Investigation of resistacne/susceptibility phenotype in the segregation population

2.3 不同抗性材料中NtMLO 基因克隆及標(biāo)記開發(fā)

以8 份供試材料的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果在不同材料中都擴(kuò)增到了預(yù)期大小的片段，測序結(jié)果如圖2 所示，感病材料中NtMLO1和NtMLO2基因的序列與參考序列相同，而臺煙7 號、KE1 中的NtMLO1基因序列在2962 ～2963 bp 存在2 個堿基的差異，從AG 突變?yōu)門A，NtMLO2基因序列缺失了第2969 ～2970 位的2 個堿基。

圖2 8 份供試材料中NtMLO1 和NtMLO2 基因的差異Fig. 2 The sequence differences of NtMLO1 and NtMLO2 in eight tested materials

利用抗、感材料中的基因序列差異，開發(fā)分子標(biāo)記，標(biāo)記序列見表2，將差異位點設(shè)計到引物的3’端，同時引入1 個堿基差異，檢測不同堿基替換對擴(kuò)增效率和特異性的影響。MLO1-R 與A-F 配對擴(kuò)增野生型材料中的NtMLO1基因，MLO1-R 與a-F 配對擴(kuò)增突變型材料中的Ntmlo1基因，MLO2-R 與B-F 配對擴(kuò)增野生型材料中的NtMLO2基因，MLO2-R 與b-F 配對擴(kuò)增突變型材料中的Ntmlo2基因。結(jié)果如圖3所示，A-F5 和A-F7 均能特異的擴(kuò)增出野生型中的NtMLO1基因，而在突變型材料中無擴(kuò)增。a-F 的7 個引物都可以特異的擴(kuò)增出突變型材料中的Ntmlo1基因，而在野生型材料中無擴(kuò)增，但是a-F4 和a-F5 的擴(kuò)增效果不好。因此選用引物對A-F7/MLO1-R 和a-F7/MLO1-R 作為NtMLO1/Ntmlo1基因的分子標(biāo)記。B-F和b-F 的引物擴(kuò)增效率和特異性都很好，選擇B-F1/MLO2-R 和b-F1/MLO2-R 作 為NtMLO2/Ntmlo2基 因的分子標(biāo)記。

圖3 NtMLO 基因分子標(biāo)記的篩選Fig. 3 Screening of NtMLO molecular markers

2.4 分子標(biāo)記在分離群體中的應(yīng)用

使用抗病材料臺煙7 號和感病材料K326 構(gòu)建分離群體，在F2 代群體中驗證分子標(biāo)記與抗性的關(guān)系。設(shè)置NtMLO1在感病品種中的基因型為A，在抗病品種中的基因型為a，NtMLO2在感病品種中的基因型為B，在抗病品種中的基因型為b。接種鑒定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有基因型為aabb 的后代表現(xiàn)為抗病，而基因型為AABB、AABb、AAbb、AaBB、AaBb、Aabb、aaBB、aaBb 的單株均表現(xiàn)為感病。利用這四對分子標(biāo)記可以明確分離后代的基因型，在雜交育種過程中可以根據(jù)基因型來選擇后代單株（圖4）。

圖4 分子標(biāo)記在F2 分離群體中的應(yīng)用Fig. 4 Application of molecular markers in the F2 segregation population

2.5 分子標(biāo)記在回交改良中的應(yīng)用

在回交改良的過程中，如果是隱性基因控制的性狀，每一代需要通過自交，鑒定后代的表型（圖5a）。利用本研究開發(fā)的兩個抗病分子標(biāo)記（a 和b）對回交后代的基因型進(jìn)行鑒定，不需要通過自交鑒定表型，即可篩選到攜帶抗性位點（a和b）的后代單株（圖5b）。

圖5 分子標(biāo)記輔助回交改良與傳統(tǒng)回交改良進(jìn)程比較Fig. 5 Comparison of molecular marker assisted backcross improvement process and traditional backcross improvement process

以回交改良K326 的BC3F1 代為例，其后代存在AABB、AABb、AaBB、AaBb 四種基因型，通過a-F7/MLO1-R 和b-F1/MLO2-R 分子標(biāo)記，對后代基因型進(jìn)行鑒定（圖6），選擇兩對引物均有擴(kuò)增，即同時攜帶a 和b 抗性位點（基因型為AaBb）的單株BC3F1-5、7、9 進(jìn)行套袋收種。

圖6 分子標(biāo)記在早代回交改良中的應(yīng)用Fig. 6 Application of molecular markers in the early backcross improvement process

高代回交材料開展自交后，開展抗性純合位點篩選結(jié)合遺傳背景鑒定，可獲得背景回復(fù)率高且攜帶抗性位點的純合株系。為獲得盡可能多的抗性單株供遺傳背景鑒定，需進(jìn)行較大規(guī)模的單株標(biāo)記鑒定，此時，采用逐步淘汰法可顯著減輕工作量。以BC6F2 為例，先使用A-F7/MLO1-R 標(biāo)記進(jìn)行篩選（圖7A），去除掉攜帶A 的單株（約占3/4），使用B-F1/MLO2-R標(biāo)記進(jìn)行篩選（圖7B），去除掉攜帶B 的單株（約占3/4），篩選出來的單株BC6F1-4 和27，使用a-F7/MLO1-R 和b-F1/MLO2-R 標(biāo)記進(jìn)行驗證（圖7C），BC6F2-4 和27 兩個單株均有擴(kuò)增，基因型為aabb。

圖7 分子標(biāo)記在回交改良純合世代中的應(yīng)用Fig. 7 Application of molecular markers in the last backcross improvement process

3 討論

煙草白粉病是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearumDC.）引起的嚴(yán)重病害，該病對煙草危害很大，發(fā)病嚴(yán)重時，白粉覆蓋葉片，使煙葉喪失經(jīng)濟(jì)價值。煙草白粉病在我國各主要產(chǎn)煙省（自治區(qū)）均有發(fā)生，而且近年來發(fā)生嚴(yán)重和區(qū)域擴(kuò)大的趨勢，已經(jīng)由煙草生產(chǎn)上的次要病害發(fā)展成為影響煙草生產(chǎn)的主要病害之一。因此開展煙草白粉病相關(guān)基因的研究及抗白粉病材料的創(chuàng)制對于該病的控制和提高煙葉質(zhì)量具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，MLO基因的突變會使植物獲得廣譜持久的白粉病抗性[18]，創(chuàng)制和利用MLO基因的突變來改良植物的白粉病抗性具有重要價值。目前，在大麥[9]、小麥[19-20]、番茄[10]、茄子[21]、蘋果[22]等植物中，都獲得了MLO基因自然突變、誘變或基因編輯的抗白粉病材料。煙草中NtMLO1和NtMLO2兩個感病基因在白粉病抗性中發(fā)揮了重要作用[12,14]，本文通過對8 份煙草資源進(jìn)行了白粉病接種和抗性鑒定，獲得了臺煙7 號和KE1 兩份抗病材料，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2份材料的白粉病抗性也是由于NtMLO1和NtMLO2基因同時發(fā)生了突變而獲得的。

開展白粉病抗源材料的高效利用和抗性轉(zhuǎn)移對煙草白粉病抗性育種具有重要價值，但由于栽培煙草是異源四倍體，NtMLO1和NtMLO2存在基因功能冗余的現(xiàn)象[14]，必須同時導(dǎo)入這兩個突變位點才能使煙草獲得白粉病抗性。通過常規(guī)育種手段開展白粉病抗性遺傳改良，存在抗性鑒定困難、抗性易丟失、育種周期長等問題，開發(fā)白粉病抗性連鎖分子標(biāo)記開展白粉病輔助選擇是提高育種效率的重要手段。本研究利用抗、感材料中NtMLO基因的序列差異開發(fā)分子標(biāo)記，利用開發(fā)的分子標(biāo)記開展了主栽品種的抗性回交改良，獲得了白粉病抗性顯著提高的新品系。

本文開發(fā)的分子標(biāo)記在煙草苗期即可確定雜交后代的抗感情況，有效解決了煙草白粉病抗性鑒定易受環(huán)境影響，抗性易丟失等問題，在煙草白粉病抗病育種中具有重要作用。該分子標(biāo)記具備以下特點：（1）成本較低，只需進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳，在短時間內(nèi)即可確定抗性位點的基因型。（2）4 對分子標(biāo)記配合使用具有共顯性特點，可有效區(qū)分雜交后代的雜合/純合基因型。（3）品種定向改良過程中，只需利用本文的a 和b 兩個分子標(biāo)記可以在回交過程中對攜帶雙突變基因型的后代單株進(jìn)行篩選，無需自交一代，無需接種鑒定，可縮短約一倍育種進(jìn)程，大規(guī)模單株篩選采用逐步淘汰法可顯著減少標(biāo)記鑒定的工作量。

4 結(jié)論

獲得了煙草白粉病抗源材料2 份，其中臺煙7 號的白粉病抗性符合雙基因隱性遺傳規(guī)律，開發(fā)了與白粉病抗性共分離的分子標(biāo)記，并應(yīng)用于主栽品種的抗性回交改良，可顯著提高煙草白粉病抗病育種效率。