林世鋒，王仁剛*，任學(xué)良，李尊強(qiáng)，元野，龍明錦，張吉順，王自力

1 貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號(hào) 550081；

2 中國煙草總公司黑龍江省煙草公司牡丹江煙草科學(xué)研究所，哈爾濱市道里區(qū)哈藥路17號(hào) 150076

由馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）引起的煙草PVY 病毒病是影響煙草生產(chǎn)的主要病害之一。實(shí)踐證明，選育和種植抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施[1]?？共》N質(zhì)資源的發(fā)掘、研究和利用是煙草抗PVY 育種的重要基礎(chǔ)。已知煙草PVY 的抗源分為兩大類，一類是以VAM（TI1406）及其衍生種質(zhì)TN86 為代表的隱性基因位點(diǎn)（VAM和va）控制的抗性[2-3]，另一類是以非洲煙草（Nicotiana africana）為代表的對(duì)PVY 免疫的抗性[4]。目前，受va位點(diǎn)控制的抗源被廣泛應(yīng)用于煙草抗病育種。為了提高va位點(diǎn)的育種利用效率，國內(nèi)外研究者相繼開發(fā)了與va位點(diǎn)相關(guān)的分子標(biāo)記，如Randomly Amplified Polymorphic DNA（RAPD） 和Sequence Characterized Amplified Region（SCAR）標(biāo)記[5-7]。這些標(biāo)記與va位點(diǎn)間的遺傳距離較遠(yuǎn)，導(dǎo)致利用標(biāo)記數(shù)據(jù)判斷抗性表型誤差較大，進(jìn)而限制了這類分子標(biāo)記在育種中的實(shí)際應(yīng)用。

在抗性獲得的研究中，Noguchis 等[5]認(rèn)為va基因型煙草植株的抗性是由于對(duì)PVY 感病的基因片段的缺失造成的。2014 年，Julio 等[8]通過更加深入的研究，進(jìn)一步明確了va基因型煙草植株對(duì)PVY的抗性是由于真核翻譯起始因子4E1（eukaryotic translation initiation factor 4E1，elF4E1）基因的缺失造成的，即eIF4E1基因?yàn)闊煵蓦[性抗PVY 基因（感病基因）。2015 年，劉勇等[9]根據(jù)煙草eIF4E1基因及其家族基因的序列信息，開發(fā)出一個(gè)與eIF4E1野生型等位基因緊密連鎖的顯性標(biāo)記，隨后利用該標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育成抗PVY 新品種云煙301[10]，但由于該標(biāo)記不能作為eIF4E1等位基因缺失的共顯性標(biāo)記，降低了其在實(shí)際育種中的應(yīng)用價(jià)值和意義。2018 年，Dluge 等[11]利用RNA 測序的方法比較了VAM基因型、va基因型和野生型三種煙草中的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在具有PVY 抗性的VAM和va基因型煙草中，真核翻譯起始因子eIF4E1基因所在的染色體區(qū)段發(fā)生大范圍的缺失，由于建立eIF4E1等位基因缺失的共顯性標(biāo)記需要了解該基因缺失連接片段的序列特點(diǎn)，而eIF4E1基因及其側(cè)翼序列的大范圍缺失，造成研究者未能有效地克隆到該基因的缺失連接片段、獲得序列信息，從而未能開發(fā)出等位基因缺失的共顯性標(biāo)記。

作物種質(zhì)資源中蘊(yùn)含著大量優(yōu)異等位基因，如何鑒定并將這些變異應(yīng)用于作物遺傳改良是種質(zhì)資源研究的中心任務(wù)之一[12]。先前研究結(jié)果表明, 在煙草種質(zhì)中存在一定數(shù)量的PVY 抗性資源，但有關(guān)種質(zhì)資源基因型，特別是有關(guān)煙草eIF4E1優(yōu)異等位基因及其特異分子標(biāo)記的研究報(bào)道甚少[13-15]。本研究目的是鑒定收集到的900 多份來自國內(nèi)外的煙草種質(zhì)資源的PVY 抗性表型，并通過抗性基因等位性測驗(yàn)和RTPCR 擴(kuò)增測序相結(jié)合的方法，分析篩選出的抗源材料所攜帶的eIF4E1基因的基因型，以期為后續(xù)煙草PVY 抗性優(yōu)異等位基因的發(fā)掘和育種利用提供基礎(chǔ)材料和信息支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種質(zhì)由貴州省煙草科學(xué)研究院提供，其中包括PVY 抗病對(duì)照煙草品種TN90 和感病對(duì)照煙草品種K326。以TN90 和K326 作母本與研究中篩選到的PVY 抗病資源作父本進(jìn)行雜交獲得F1 代雜交種材料，用于抗病資源中PVY 抗性基因的等位性檢測。

1.2 PVY 人工接種

以普遍發(fā)生的脈壞死株系（PVYN）為接種毒源，由貴州省煙草科學(xué)研究院品種選育三室分離和保存?？筆VY 測試采用常規(guī)汁液摩擦接種法[16]。

1.3 煙草基因組DNA 的提取

采用AxyPrep 基因組DNA 小量制備試劑盒（Axygen）提取煙草基因組DNA，并通過紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測基因組DNA 的提取質(zhì)量。

1.4 煙草RNA 提取和cDNA 合成

采用Invitrogen 公司的Trizol 試劑盒提取總RNA。cDNA 第一鏈的合成按照TaKaRa 公司的PrimeScriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit 說明書進(jìn)行。

1.5 煙草eIF4E1 基因的特異分子標(biāo)記檢測

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成eIF4E1野生型等位基因的5’端顯性分子標(biāo)記引物[9]、開陽小黑煙和福泉柳葉煙eIF4E1突變型等位基因的共顯性分子標(biāo)記引物[17-18]及內(nèi)參基因NR（硝酸還原酶基因）的特異性引物[19]，同時(shí)設(shè)計(jì)合成eIF4E1野生型等位基因的3’端顯性分子標(biāo)記引物（表1），對(duì)篩選到的PVY 抗病資源中的eIF4E1基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.6 煙草eIF4E1 基因的全長cDNA 擴(kuò)增

根據(jù)文獻(xiàn)[20]合成eIF4E1基因全長序列擴(kuò)增引物（表1），以各自煙草cDNA 為模板擴(kuò)增eIF4E1基因全長cDNA 序列。PCR 擴(kuò)增體系：TaKaRa LA Taq 酶0.25 μL，10×LA Taq Bufer Ⅱ2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，正向引物（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，加入ddH2O 補(bǔ)平至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min（30個(gè)循環(huán)），最后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物電泳檢測，送上海生工公司進(jìn)行基因測序。

表1 本研究所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 抗性表型鑒定

從900 多份種質(zhì)資源中，通過苗期盆栽人工接種PVY 抗性鑒定，獲得抗PVY 資源開陽小黑煙、半坤村曬煙等19 份（表2）?？筆VY 資源大部分屬于我國地方性曬煙及黃花煙品種。

表2 抗PVY 的煙草種質(zhì)資源信息Tab. 2 The information of the tobacco germplasm resource with resistance to PVY

2.2 與TN90 抗病位點(diǎn)的等位性檢測

已知白肋煙品種TN90 對(duì)PVY 的抗性是由隱性基因位點(diǎn)（va）控制的，具體而言是由煙草PVY 感病基因eIF4E1缺失造成的[11,21]。為檢測抗PVY 資源與TN90 對(duì)PVY 抗性間的等位性關(guān)系，利用抗PVY資源與TN90 及感病品種K326 配制抗抗及抗感雜交組合，各選取60 個(gè)F1代單株，通過人工摩擦接種法進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，19 份抗PVY 資源與TN90 配制抗抗組合的F1代單株均表現(xiàn)為抗病，而19 份抗PVY 資源與K326 配制抗感組合的F1代單株均表現(xiàn)為感病。上述結(jié)果表明，篩選到的19 份抗PVY 資源與TN90 的PVY 抗病基因間具有等位性，即推斷19份抗PVY 資源的PVY 抗性均是由感病基因eIF4E1缺失造成的。

2.3 eIF4E1 基因的特異分子標(biāo)記檢測

近年來研究發(fā)現(xiàn)煙草抗PVY 材料的eIF4E1基因可發(fā)生數(shù)種不同形式的突變，包括最為常見的基因全序列缺失突變[11]，及單堿基插入和大片段缺失突變等[18,20]；相繼開發(fā)了不同的分子標(biāo)記，包括煙草eIF4E1野生型等位基因5’端顯性分子標(biāo)記[9]、開陽小黑煙eIF4E1突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記[17]和福泉柳葉煙eIF4E1突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記[18]，這些分子標(biāo)記的相對(duì)位置如圖1 所示。考慮到上述分子標(biāo)記的檢測范圍未能涵蓋煙草eIF4E1基因3’端，本研究另外在煙草eIF4E1基因3’端設(shè)計(jì)了煙草eIF4E1野生型等位基因3’端顯性分子標(biāo)記（圖1）。接著本研究利用4 種分子標(biāo)記引物對(duì)19 份抗PVY 資源和1 份感PVY 資源進(jìn)行PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果顯示，4 種分子標(biāo)記將20 份資源區(qū)分為4 個(gè)標(biāo)記基因型（圖2）。標(biāo)記基因型A 包括開陽小黑煙、壩林曬煙、光柄柳葉（木）、一朵花、勐海鄉(xiāng)曬煙（二）、盤縣大柳葉和冊亨威旁土煙共7 份抗病資源。標(biāo)記基因型B 包括半坤村曬煙和K326，其中半坤村曬煙表型鑒定為抗PVY，K326 表型鑒定為感PVY。標(biāo)記基因型C 只包括抗PVY 資源福泉柳葉煙，已知福泉柳葉煙eIF4E1基因3’端發(fā)生大片段缺失（部分缺失）[18]。標(biāo)記基因型D 包括普安付耳煙（3）、C151、NC55、TN86、Havana 10、Criodllo Salteno 11、陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、茄子煙、建平大蘭花煙共10 份抗病資源，利用4 種分子標(biāo)記引物擴(kuò)增均未產(chǎn)生任何條帶，初步推測這10 份抗病資源eIF4E1基因發(fā)生了完全缺失。

圖1 煙草eIF4E1 基因的4 種分子標(biāo)記在基因組上的相對(duì)位置示意圖Fig. 1 Relative positions of four molecular markers of tobacco eIF4E1 gene in the genome

圖2 抗PVY 煙草種質(zhì)資源中eIF4E1 基因的分子標(biāo)記檢測Fig. 2 Molecular marker detection of eIF4E1 gene in tobacco germplasm resources resistant to PVY

2.4 eIF4E1 基因的RT-PCR 擴(kuò)增及序列分析

應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)對(duì)19 份抗PVY 資源的eIF4E1基因進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增和序列測定，結(jié)果顯示，在福泉柳葉煙、普安付耳煙（3）、C151、NC55、TN86、Havana 10、Criodllo Salteno 11、陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、茄子煙和建平大蘭花煙等11 份種質(zhì)資源中未能擴(kuò)增出eIF4E1基因的全長cDNA 序列（圖3），已知在福泉柳葉煙中eIF4E1基因發(fā)生3’端大片段缺失（該種突變型等位基因被命名為eIF4E1.F），結(jié)合eIF4E1基因的特異分子標(biāo)記檢測結(jié)果，推測其他10 份種質(zhì)資源中eIF4E1基因發(fā)生了完全缺失；在開陽小黑煙、壩林曬煙、光柄柳葉（木）、一朵花、勐海鄉(xiāng)曬煙（二）、盤縣大柳葉和冊亨威旁土煙等7份種質(zhì)資源中均能擴(kuò)增出兩個(gè)大小不同的條帶（圖3），進(jìn)一步測序顯示eIF4E1基因在這些資源中存在兩種剪接模式（圖4），其原因在于eIF4E1基因1號(hào)外顯子3’端發(fā)生單一堿基（T）插入突變影響到部分前體RNA 內(nèi)含子1 的正確剪接（GT-AG 法則），導(dǎo)致下游2 號(hào)外顯子發(fā)生跳躍缺失突變，考慮到此種突變型等位基因最初在開陽小黑煙中被發(fā)現(xiàn)，故將其命名為eIF4E1.K[20]；與上述eIF4E1基因突變類型不同，在半坤村曬煙中可以擴(kuò)增出與感病品種K326 一樣的單一條帶（圖3），測序結(jié)果顯示，半坤村曬煙的eIF4E1基因編碼區(qū)（CDS）第149 位堿基處存在一個(gè)等位基因突變，即由G 突變?yōu)镃（圖4），從而導(dǎo)致相應(yīng)編碼的蛋白質(zhì)第50 位氨基酸殘基由色氨酸（W）突變?yōu)榻z氨酸（S），為將半坤村曬煙中發(fā)現(xiàn)的eIF4E1突變型等位基因與其他突變型等位基因區(qū)分開來，我們將半坤村曬煙中發(fā)現(xiàn)的eIF4E1突變型等位基因命名為eIF4E1.B。

圖3 煙草eIF4E1 基因的全長cDNA 序列的PCR 擴(kuò)增Fig. 3 PCR amplification of the full-length cDNA sequence of eIF4E1 gene in tobacco

圖4 煙草eIF4E1 野生型與突變型等位基因的全長cDNA 序列比對(duì)Fig. 4 Alignment of the full-length cDNA sequences of wild-type and mutant alleles of eIF4E1 in tobacco

3 討論

溫室盆栽苗期人工接種鑒定結(jié)果，19 份煙草種質(zhì)資源對(duì)PVY 表現(xiàn)為高抗，其中開陽小黑煙、壩林曬煙、半坤村曬煙、福泉柳葉煙、C151、NC55、TN86、Havana 10、Criodllo Salteno 11、陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、建平大蘭花煙等12 份資源PVY 抗性在先前文獻(xiàn)中已有報(bào)道[9,13,15,18,20]，但除開陽小黑煙、福泉柳葉煙、C151、NC55 和TN86 等5 份種質(zhì)資源外，對(duì)其他種質(zhì)資源中PVY 感病基因eIF4E1的基因型未見報(bào)道。已知目前煙草育種利用的PVY 抗源可能全部衍生自煙草資源VAM，利用VAM 抗源及其衍生抗源育成的抗PVY 煙草品種包括白肋煙品種TN86、TN90 和烤煙品種NC744、NC55、NC102 等，但是在這些抗源及育成的抗病品種中往往圍繞著eIF4E1基因及其側(cè)翼序列的染色體區(qū)域發(fā)生了大范圍的缺失，其中涵蓋上百個(gè)基因的缺失[11]。上述染色體區(qū)域的大范圍缺失及無法獲得缺失連接片段序列信息不僅造成eIF4E1基因位點(diǎn)野生型和突變型共顯性分子標(biāo)記難以開發(fā)，不利于隱性性狀的選擇，而且也會(huì)由于一些功能基因的缺失帶來不利的農(nóng)藝性狀。早有研究報(bào)道，VAM 基因型抗源材料的PVY 抗性存在連鎖累贅，如葉片短小、產(chǎn)量較低、缺乏葉面分泌物等[22-23]。這些連鎖累贅現(xiàn)象可能與eIF4E1基因上下游大量功能基因的缺失相關(guān)，因此即使針對(duì)這類抗源材料設(shè)計(jì)出共顯性標(biāo)記用于回交育種輔助選擇或增加回交次數(shù)，也無法打破PVY 抗性定向改良帶來的連鎖累贅。

為克服或避開上述問題的困擾，本研究從鑒定煙草種質(zhì)資源抗PVY 表型和基因型入手，通過分析發(fā)現(xiàn)所有篩選到的抗病資源無一例外在eIF4E1基因位點(diǎn)發(fā)生了不同類型的突變，其中篩選到的曬煙和黃花煙抗病資源均是我國地方品種（又稱農(nóng)家品種），是經(jīng)過長期的自然繁衍、淘汰及人工馴化選擇的結(jié)果，不涉及人工誘變或基因修飾。盡管篩選到的所有抗病農(nóng)家品種均是由于eIF4E1基因位點(diǎn)發(fā)生自然突變造成的結(jié)果，還不能說明eIF4E1基因是煙草抗PVY 的唯一機(jī)制，但可能表明eIF4E1基因位點(diǎn)是目前進(jìn)行煙草抗PVY 品種選育的最佳靶向位點(diǎn)，不會(huì)對(duì)其他農(nóng)藝性狀帶來負(fù)面效應(yīng)或帶來的負(fù)面效應(yīng)相對(duì)較小，同時(shí)利用篩選到的eIF4E1單個(gè)基因突變的抗病資源（如開陽小黑煙或半坤村曬煙）也可能消除或減小圍繞eIF4E1基因位點(diǎn)發(fā)生大量基因缺失突變的抗病資源（如TN90 或NC55）作為供體親本帶來的負(fù)面效應(yīng)。然而，需要指出的是，近年來，國內(nèi)外學(xué)者先后在煙草上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)能夠突破eIF4E1基因型抗性的PVY毒株[24-27]，于此同時(shí)，在煙草中發(fā)現(xiàn)了與之對(duì)應(yīng)的新的隱性抗病基因eIF(iso)4E-T[28]。因此，今后如果能夠針對(duì)兩個(gè)隱性抗病基因eIF4E1和eIF(iso)4E-T進(jìn)行煙草種質(zhì)資源抗PVY 優(yōu)異等位變異的挖掘和聚合育種，勢必可以創(chuàng)制出賦予煙草對(duì)絕大多數(shù)PVY 病毒株系抗性的新品種[27]。

回交育種對(duì)帶有個(gè)別不良性狀的品種改良是一種較好的育種途徑，而分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）因其對(duì)目標(biāo)基因的快速準(zhǔn)確選擇為回交育種提供了有效工具[29]。由于eIF4E1基因是隱性抗病基因，在以選擇雜合個(gè)體為目標(biāo)的回交轉(zhuǎn)育過程中，以擴(kuò)增eIF4E1野生型等位基因?yàn)槟繕?biāo)的顯性分子標(biāo)記不能有效識(shí)別含有eIF4E1突變型等位基因的雜合個(gè)體，仍需通過逐代測交或自交的方法鑒定基因型，不盡完美。鑒于共顯性的分子標(biāo)記允許在回交轉(zhuǎn)育雜合體階段進(jìn)行隱性基因的鑒定，無需進(jìn)行測交或自交檢驗(yàn)，節(jié)省選育時(shí)間，本研究對(duì)煙草種質(zhì)資源抗PVY 表型和基因型進(jìn)行鑒定，篩選到多個(gè)新的抗病資源，并獲得了各個(gè)抗病資源eIF4E1基因突變序列信息，為建立煙草PVY 隱性抗病基因eIF4E1的共顯性分子標(biāo)記提供了可能，為提高煙草PVY 抗病育種選擇效率，加快品種改良進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從900 多份煙草種質(zhì)資源中篩選出19 份高抗PVY 資源，其中14 份為中國煙草地方品種資源。通過抗性基因等位性測驗(yàn)，初步推斷19 份抗源的PVYN抗性由隱性抗病基因eIF4E1所控制。通過序列分析，確定19 份抗源中eIF4E1基因存在4 種突變類型，包括單堿基插入、替換、基因片段部分或完全缺失。這些結(jié)果為煙草PVY 抗病育種中抗病材料的選擇提供了依據(jù)，也為煙草抗PVY 共顯性分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用提供了可能，從而有利于提高育種效率，加快育種進(jìn)程。