孫雙權(quán)，陳立新，唐春華，李慧，楊誼

上海市松江區(qū)中心醫(yī)院泌尿外科，上海 201600

膀胱癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，對患者的生理、心理及社會生活質(zhì)量均造成了嚴重的不利影響[1]。約75%的膀胱尿路上皮癌患者表現(xiàn)為非肌層浸潤性膀胱癌，25%的患者表現(xiàn)為肌層浸潤性膀胱癌。對于非肌層浸潤性膀胱癌患者，手術(shù)切除術(shù)后常規(guī)行膀胱灌注治療，但效果并不理想。臨床上迫切需要更為有效的治療方法來降低非肌層浸潤性膀胱癌患者的手術(shù)后復(fù)發(fā)率。目前新的研究方向包括免疫抑制治療，針對長鏈非編碼RNAs、micro RNAs或腫瘤干細胞的靶向治療方法等[2]。

微小核糖核酸(MicroRNA)是由19～25個核苷酸組成的非編碼的單鏈RNA，其與腫瘤細胞的增殖、分化、遷移及凋亡密切相關(guān)。通過與mRNA的3'UTR結(jié)合，miRNA可以導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解。單個miRNA可以靶向多個mRNAs，而單個mRNA的3'UTR也可能包含多個miRNAs的識別信號。microRNA-222(miR-222)屬于miR-221/222家族。研究發(fā)現(xiàn)，miR-222在膀胱癌組織中的表達水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，其高表達與腫瘤分級和分期顯著相關(guān)[3]，而且miR-222的過度表達對TaT1期患者的短期復(fù)發(fā)和進展有較好的陽性預(yù)測價值[4]，其有可能成為一種膀胱癌早期發(fā)現(xiàn)進展或復(fù)發(fā)的隨訪標記物，甚至是治療膀胱癌患者的有用靶點[5]。

CDKN1B基因編碼一種細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(p27)，與CDK抑制劑CDKN1A/P21具有相似性，其參與了多種腫瘤的發(fā)生過程。CALLEGARI等[6]通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，在鼠肝癌模型中，miR-221的表達上調(diào)同時伴隨有CDKN1B/p27和CDKN1C/p57表達的顯著抑制。在很多人類的癌細胞中，miR221/222可能通過靶向調(diào)控CDKN1B的表達，促進癌細胞的增殖，包括胰腺癌、肝癌及非小細胞肺癌[7-9]。本研究定量檢測了膀胱尿路上皮癌組織及癌旁組織中miR-222及CDKN1B(p27)的表達差異，觀察miR-222對膀胱癌T24細胞增殖、遷移及凋亡的影響，并對miR-222的可能靶點CDKN1B進行了雙熒光素酶報告基因檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、臨床組織樣本 人膀胱癌細胞株T24購自上海中科院細胞庫；收集2018年1月至2019年6月45例在上海市松江區(qū)中心醫(yī)院確診并行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)的膀胱尿路上皮癌患者的膀胱癌組織標本及配對癌旁組織。本研究通過本院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書，標本采用液氮保存。

1.1.2 儀器及實驗試劑 DMEM細胞培養(yǎng)液和胎牛血清、雙抗、PBS緩沖液從美國GIBCO公司買入。CDKN1B抗體購自Abcam公司，Lip2000試劑從美國Invitrogen公司購買；MTT檢測試劑盒購自南京凱 基，miR-222 inhibitor NC、miR-222 inhibitor和miR-222 mimic均由上海吉瑪生物公司合成；高速冷凍離心機購自Sigma公司，紫外分光光度計購自Beckman公司，CFX384多重實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。TRIzol?Plus RNA Purification Kit(貨號：12183-555)購自Invitrogen公司，RNase-Free DNase Set(貨號：79254)購自Qiagen公司，Super-ScriptTMⅢReverse Transcriptase(貨號：18080085)購自Thermo fisher公司和PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(貨號：A25779)購自Applied Biosystems公司，引物miR-222和U6均由華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 Real time PCR檢測miR-222表達水平 總RNA抽提：取50 mg的樣本組織，加1 mL Trizol研磨勻漿，加1/2 Trizol體積的氯仿提取，并用異丙醇或純酒精沉淀RNA后用DEPC水溶解，用紫外分光光度計定量并檢測純度；PCR擴增：取1μg RNA用Super-ScriptTMⅢReverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green染料法進行擴增檢測miR-222的相對表達量。逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物序列miR-222(基因序列號為MIMAT0004569)：ATTCGCACTGGATACGACGGTCAG；用Primer Premier 6.0設(shè)計PCR引 物，miR-222-F：CGCGCTCAGTAGCCAGTGTA，SNORD48(內(nèi)參)-F：GATGATGACCCCA-GGTAACTCT，反向通用引物micro-R為：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。反應(yīng)體系為：在20μL的體系中加Power SYBR?Green Master Mix 10μL，10μmol/L Forward Primer 0.5μL，10μmol/L micro-R 0.5μL，SDW 8μL，CDNA 1.0μL，用DEPC水定容到總體積20μL。反應(yīng)條件：95℃，1 min，1個循環(huán)；95℃，15 s，60℃，25 s，40個循環(huán)，收集熒光在60℃處；55℃～95℃繪制溶解曲線。每個樣品重復(fù)三次，用2-ΔΔct法統(tǒng)計分析基因的相對表達量。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細胞株 使用DME培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗，于5%CO2、37℃的無菌環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液一次，4～5 d傳代一次，將對數(shù)生長期細胞接種鋪板在6孔板里面，24 h后進行細胞轉(zhuǎn)染。細胞實驗分組：control組(空白膀胱癌T24細胞株)、miR-222 inhibitor NC組、miR-222 inhibitor組和miR-222 mimic組，共四組。細胞轉(zhuǎn)染：將miR-222 inhibitor NC、miR-222 inhibitor和miR-222 mimic，按照15 nmol/mL加入到250μL培養(yǎng)液里面，同時取10μL Lip2000加入到250μL培養(yǎng)液里面，靜置5 min，前兩者混合在一起，miRNA溶液與脂質(zhì)體混和均勻，室溫靜置20 min，培養(yǎng)板上的細胞棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)洗滌細胞1～2次。每孔細胞加500μL miRNA/脂質(zhì)體混合物，輕輕搖晃混勻后，置于細胞培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h。取出培養(yǎng)板，小心吸去miRNA/脂質(zhì)體混合物，每孔加500μL新鮮的含血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后期檢測。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖 將上述處理完成的細胞，進行胰酶消化，吹打變成單細胞懸液，按照每空1萬個細胞，終體積為100μL，接種到96孔板內(nèi)，并且設(shè)置了空白孔，每組4重復(fù)，進行培養(yǎng)1D、2D、3D后，加入20μL MTT(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)孵育4 h，扔掉孔內(nèi)上清液，加入150μL DMSO，搖床震蕩培養(yǎng)直至結(jié)晶物溶解完成，酶標儀挑取合成的程序，OD490nm讀值，最后用軟件制作生長曲線。

1.2.4 細胞遷移實驗 將所有細胞培養(yǎng)試劑和Transwell小室置于37℃恒溫水浴箱溫育。收集對數(shù)生長期細胞，消化細胞后用無血清培養(yǎng)基混勻細胞，計數(shù)后，調(diào)整濃度為每毫升10個細胞。在下室(即24孔板底部)加入600μL含20%血清的培養(yǎng)液。上室加入單細胞懸液150μL，37℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗結(jié)束后用鑷子小心夾出小室，吸干上室液體，甲醇室溫固定30 min。取出小室，吸干上室固定液，結(jié)晶紫染液室溫染色15～30 min，PBS沖洗多次，用自制脫脂棉棒輕輕吸去上室殘留液體，并取掉底膜殘留細胞，完成后取出小室，底膜晾干，然后封片，顯微鏡下拍照并計數(shù)隨機細胞視野5個，SPSS統(tǒng)計分析。

1.2.5 Annexin V-FITC細胞凋亡實驗 收集的細胞用PBS重懸細胞并計數(shù)。取1×106萬細胞，1 000 r/min離心5 min后丟掉上清液，加入500μL的Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕混勻細胞，再加入5μL Annexin V-FITC探針，輕輕混勻，25℃，避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，丟掉上清，加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.6 MiR-222與CDKN1B的結(jié)合關(guān)系測定 采用雙熒光素酶報告實驗，利用生物信息預(yù)測網(wǎng)站(miRbase.org，Targetscan.org)預(yù)測miR-222與CDKN1B的結(jié)合片段。將擴增的CDKN1B 3'-UTR序列插入到pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒位點當中，分別構(gòu)建pGL3-CDKN1B-3'UTR WT和pGL3-CDKN1B-3'UTR Mut的熒光素酶報告載體(pMIR-Report Luciferase)，將上述熒光素酶報告載體及突變載體與miR-222 NC、miR-222 mimic、miR-222 inhibitor共同轉(zhuǎn)染至T24細胞，Dual Luciferase報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性，分析miR-222與CDKN1B的結(jié)合關(guān)系。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 取適量細胞，用冰PBS洗滌3次。取適量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，比例為1：100，在冰上裂解20 min。11 000 r/min的速度離心10 min，取上清。測定和調(diào)節(jié)蛋白濃度，保持每孔的加樣量在30μg。將準備好的樣品和蛋白質(zhì)marker(10～180 kD)，分別上樣電泳直至電泳完全。然后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋好的一抗抗體，4℃過夜。二抗室溫1 h振蕩孵育，最后ECL化學(xué)發(fā)光曝光顯色。

1.2.8 免疫組化染色 膀胱癌及癌旁組織固定、脫水、包埋、切片，除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，抗原修復(fù)高壓鍋修復(fù)：立即投入檸檬酸緩沖液，等到沸騰，浮子升起，計時2 min，自然冷卻至室溫；血清封閉、加入稀釋好的一抗抗體，4℃過夜。二抗室溫1 h振蕩孵育。加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染后，封片、顯微鏡下拍照，數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 每組實驗均安排重復(fù)三次，采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，進一步兩兩比較采用Dunnet-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-222在膀胱癌和癌旁組織中的表達差異 45例手術(shù)后病理證實為膀胱尿路上皮癌的標本經(jīng)Real time PCR檢測結(jié)果顯示：膀胱癌組織組miR-222基因表達量為2.31±0.27，癌旁組織組miR-222基因表達量為0.92±0.04，膀胱癌組織miR-222基因表達量約為癌旁組織的2.2倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.481，P<0.05)。

2.2 MTT法檢測細胞增殖 為了研究miR-222對膀胱癌細胞增殖的影響，將miR-222模擬物(miR-222 mimic)、抑制劑(miR-222 inhibitor)及其陰性對照物(miR-222 inhibitor NC)轉(zhuǎn)染T24細胞，從以下生長曲線可以看出，control組與miR-222 inhibitor NC組生長基本持平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但miR-222 inhibitor組和miR-222 mimic組顯示出明顯的生長差異，miR-222 inhibitor組明顯低于其余組，而miR-222 mimic組明顯高于miR-222 inhibitor組和其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組T24細胞的生長曲線

2.3 細胞遷移實驗結(jié)果 細胞遷移實驗結(jié)果顯示，miR-222 mimic組的細胞遷移數(shù)量為(220±26)個，明顯多于miR-222 inhibitor組的(90±15)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.263，P<0.01)，control組細胞遷移數(shù)量多于miR-222 inhibitor組，但是低于miR-222 mimic組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和圖3。

圖2 不同處理組細胞的遷移數(shù)量(×100)

圖3 各組T24細胞的遷移數(shù)量結(jié)果

2.4 Annexin V-FITC細胞凋亡實驗結(jié)果 流式結(jié)果顯示，miR-222 mimic組的凋亡率明顯低于抑制了miR-222表達的miR-222 inhibitor組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，也低于正常的control組和miR-222 inhibitor NC組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4和圖5。

圖4 各組T24細胞流式凋亡圖片

圖5 各組T24細胞流式凋亡結(jié)果比較

2.5 MiR-222與CDKN1B的結(jié)合關(guān)系測定及Western blot分析 采用生物信息學(xué)預(yù)測到miR-222與CDKN1B mRNA 3'UTR存在結(jié)合位點，見圖6A；熒光素酶活性報告分析顯示，與miR-222 NC組相比，miR-222組WT細胞的熒光活性表達量顯著降低，MUT細胞的熒光活性表達量不受影響，見圖6B；Western blot結(jié)果顯示：與control組相比，miR-222 mimic組T24細胞中CDKN1B(p27)蛋白表達量顯著降低，與miR-222 inhibitor NC組相比，miR-222 inhibitor組T24細胞中CDKN1B(p27)蛋白表達量明顯升高，見圖6C、6D，各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 組織免疫組化染色結(jié)果 為了證明CDKN1B(p27)蛋白在細胞中的分布與表達差異，對膀胱癌組織和癌旁組織進行了免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示：CDKN1B(p27)蛋白主要定位于細胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色。結(jié)果表明，與癌旁組織相比，CDKN1B(p27)蛋白在膀胱癌組織中的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7和圖8。

圖8 膀胱癌和癌旁組織中的CDKN1B(p27)蛋白的表達量

3 討論

膀胱腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的多基因調(diào)控過程。miRNA通過誘導(dǎo)降解或阻斷翻譯來抑制基因表達，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。miR-221與miR-222在結(jié)構(gòu)和功能上具有較大的相似性，在多種人類腫瘤中發(fā)揮了重要作用，如膀胱癌、前列腺癌、胃癌及甲狀腺癌等[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-222在膀胱腫瘤組織中的表達水平明顯高于相應(yīng)的非癌組織[14]，高級別尿路上皮癌比低級別尿路上皮癌組織中miR-222水平高，肌層浸潤性膀胱癌(T2-T4)比淺表性膀胱癌(TaT1)組織中miR-222水平高,過度表達miR-222的患者在治療后短期復(fù)發(fā)和進展的風險更大[4]。本實驗用熒光定量PCR法檢測了miR-222在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達差異，結(jié)果表明，miR-222在膀胱癌組織中的表達遠高于癌旁組織中的表達。在體外細胞學(xué)實驗中，轉(zhuǎn)染miR-222 mimic使miR-222在膀胱癌T24細胞中表達上調(diào)可使細胞增殖及遷移能力增強，并抑制癌細胞的凋亡，而下調(diào)miR-222則明顯降低了膀胱癌T24細胞增殖和遷移能力，促進癌細胞的凋亡。這些研究表明，在體外，miR-222具有促進膀胱癌發(fā)生發(fā)展的作用。

細胞周期的進展需要細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)的特異性激活。CDK抑制因子包括兩個家族：CDK4家族和CIP/KIP家族(激酶抑制蛋白)，后者包括p21、p27(CDKN1B)和p57。CDKN1B基因定位于12號染色體短臂，編碼p27蛋白。p27是由198個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是一種關(guān)鍵的細胞周期調(diào)節(jié)因子，可以通過其N末端結(jié)構(gòu)域與細胞周期蛋白和CDK亞單位相互作用來抑制細胞周期蛋白D、E和B-CDK復(fù)合物的催化活性，參與細胞分化、增殖和凋亡[15-16]。p27增加2～3倍可以完全抑制G1～S期細胞周期蛋白CDK，阻止細胞周期從G期進展到S期。CDKN1B(p27)在表達水平和亞細胞定位上都受到調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN1B參與了許多腫瘤的發(fā)生過程，如多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤、急性淋巴細胞白血病、黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤等[17]，其表達的缺失或下降與許多腫瘤的侵襲行為有關(guān)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及肺癌等[18]。在本研究中，通過膀胱癌組織和癌旁組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CDKN1B(p27)在膀胱癌組織中的表達與癌旁組織相比顯著降低，證實CDKN1B參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程。目前的研究表明，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控CDKN1B的表達和分布。PI3K-AKT途徑通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控CDKN1B蛋白的表達，而泛素-蛋白酶體水解是CDKN1B轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的主要途徑，Ras-MAKP通路是參與這一過程最可能的信號通路。CDKN1B還與許多細胞內(nèi)和細胞外的分子存在相互作用，如Ras、Spy1、SKP2及CRM1等。

很多腫瘤抑制因子是miR-221和miR-222在癌癥中的靶點，包括細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN1B/p27和CDKN1C/p57[19]，14磷酸肌醇3激酶途徑磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)的抑制劑、促凋亡蛋白B細胞淋巴瘤2-修飾因子(BMF)等。在肝癌細胞中，miR-221和miR-222的可能作用靶點包括p27、p57、BBC3及TIMP3等[20]。在高侵襲性胰腺導(dǎo)管腺癌中，miR-222的表達明顯增高，其可以通過抑制PPP2R2A激活A(yù)KT，促進p27磷酸化，增強癌細胞侵襲和增殖能力[7]。在人類卵巢癌細胞中，p27是miR-222的直接靶點，上調(diào)miR-222能夠促進卵巢癌細胞增殖[21]。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN1B基因的3'UTR有兩個位點與miR-222種子序列相匹配，miR-222可能調(diào)節(jié)p27mRNA的翻譯及蛋白質(zhì)表達水平，但并不影響mRNA的水平，僅在CDKN1B3'UTR的一個靶位點中修飾不足以阻斷miR-222的功能。在本研究中，通過雙熒光素酶報告基因檢測分析表明，在膀胱癌T24細胞中，CDKN1B可能是miR-222的直接靶點之一，miR-222對其具有負向調(diào)控的作用,導(dǎo)致p27表達下降，細胞周期進展，促進腫瘤細胞的增殖與遷移。Western blot分析也進一步證實，與對照組相比，增加miR-222的表達能明顯抑制p27的表達，而抑制miR-222的表達則能明顯增加p27的表達。但是，p27可能并不是miR-222的唯一靶點，其也可以通過靶向編碼p27蛋白降解的基因來間接參與p27蛋白水平的調(diào)節(jié)，其具體的分子機制仍需進一步深入的研究。

總之，本研究證實了miR-222在膀胱癌組織中的表達明顯上調(diào)，下調(diào)miR-222可以明顯抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移能力，并且促進膀胱癌細胞的凋亡；miR-222可能通過負向調(diào)控抑癌基因CDKN1B表達來發(fā)揮作用，其可能作為膀胱癌檢測與治療的一個潛在靶點。