楊新選，任航

咸陽市第一人民醫(yī)院泌尿外科，陜西 咸陽 712000

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)三大常見惡性腫瘤之一。2020年全球膀胱癌新發(fā)病例573 278例，死亡病例212 536例，分別占癌癥發(fā)病和死亡病例的3.0%、2.1%[1]。膀胱癌發(fā)病具有隱匿性，患者多因肉眼血尿就診，已失去最佳治療時(shí)間。膀胱鏡雖然是診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但屬有創(chuàng)操作，痛苦較大，因此尋找有效、可靠、便捷的生物學(xué)標(biāo)志物很有必要。微小RNAs(microRNAs，miRs)是一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的非編碼RNAs，研究表明，膀胱癌患者體內(nèi)存在多種miRs異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。miR-143、miR-145均位于人類5號(hào)染色體，miR-144位于人類7號(hào)染色體，在多種腫瘤中呈低表達(dá)，具有抗癌基因作用，如乳腺癌中，miR-143可通過降低細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]；miR-144可通過抑制中心體相關(guān)蛋白55抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移[4]；miR-145可通過靶向雌激素受體-α抑制腫瘤細(xì)胞的侵略性等[5]。本研究分析膀胱癌患者血清miR-143、miR-144和miR-145水平變化，并探討三者與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系及其對(duì)膀胱癌臨床診斷的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取咸陽市第一人民醫(yī)院泌尿外科2016年1月至2017年1月收治的83例膀胱癌患者為膀胱癌組，其中男性49例，女性34例；年齡47～83歲，平均(62.58±8.74)歲；腫瘤直徑1.2～5.6 cm，平均(3.21±0.87)cm；TNM分期：Ta期12例，T1期19例，T2期17例，T3期31例，T4期4例；分化程度：未分化6例，低分化35例，中分化19例，高分化23例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者47例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《歐洲腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)膀胱癌診斷、治療和隨訪實(shí)踐指南》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)患者及家屬均知情同意；(3)臨床資料完整；(4)可接受隨訪者；(5)意識(shí)清楚。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血液系統(tǒng)疾病者；(2)全身免疫性疾病者；(3)重要臟器功能損害者；(4)合并其他惡性腫瘤者；(5)近1個(gè)月內(nèi)接受激素和免疫制劑治療者。另選取同時(shí)期48例在我院體檢的健康者為對(duì)照組，其中男性28例，女性20例；年齡38～78歲，平均(61.58±7.83)歲。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法 收集兩組受檢者5 mL空腹靜脈血，室溫靜置10 min，1 000 r/min離心1 min，分離血清，總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：R1200)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州海基生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：D1802)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。miR-143上游引物：5'-TGAGATGAAG CACTGT-3'，下 游 引 物：5'-ACATCGACTGTAGCATA-3'；miR-144上游引物：5'-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCGGAGGT-3'；miR-145上游引物：5'-TCCGATTGAGTCATTACCAT-3'，下 游 引 物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。反應(yīng)體系：10μL SYBR GreenⅠMaster、1.0μL引物、2μL DNA模板、8.5μL RNase-Free H2O；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火35 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。以U6做內(nèi)參基因，上游引物：5'-CAGGGGCCATGCTAAATCTTC-3'，下 游 引 物：5'-CTTGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反 應(yīng) 結(jié) 束后得到各反應(yīng)管Ct，2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-143、miR-144、miR-145相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 通過電話和門診隨訪等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止2020年1月30日，總生存期定義為化療開始到隨訪截止時(shí)間或死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料以[M(P25，P75)]表示，采用Z檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間生存率Log-rank檢驗(yàn)；受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析指標(biāo)對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值，曲線下面積(area under curve，AUC)采用Z檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比較 膀胱癌組血清miR-143、miR-144、miR-145水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比較(±s)

表1 兩組受檢者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比較(±s)

組別膀胱癌組對(duì)照組t值P值例數(shù)83 48 miR-143 0.20±0.07 1.07±0.36-16.672 0.001 miR-144 0.54±0.11 0.89±0.18-12.194 0.001 miR-145 1.37±0.72 5.66±1.76-16.107 0.001

2.2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系[±s，M(P25，P75)]

表2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系[±s，M(P25，P75)]

病理特征性別例數(shù)miR-143 t值-0.254 P值0.800 miR-144t值1.553 P值0.124 miR-145 t值-1.643 P值0.106男女49 34 0.20±0.06 0.21±0.07 0.56±0.11 0.52±0.12 1.26±0.60 1.54±0.84年齡(歲)≥60<60腫瘤大小(cm)≥3<3 TNM分期Ta～T1 T2～T4分化程度低未分化中高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46 37 43 40 31 52 41 42 0.20±0.07 0.21±0.06 0.19±0.07 0.22±0.06 0.22±0.07 0.19±0.06 0.19±0.07 0.22±0.06-1.369-1.917 2.154-1.675-2.684 0.175 0.059 0.034 0.098 0.009 0.54±0.12 0.55±0.11 0.51(0.46,0.59)0.56(0.46,0.65)0.58±0.10 0.52±0.12 0.52±0.10 0.56±0.13-0.386-1.044 2.084-1.658-2.359 0.700 0.296 0.040 0.101 0.021 1.34±0.80 1.42±0.62 1.24±0.76 1.52±0.65 1.57±0.60 1.26±0.76 1.29±0.81 1.45±0.61-0.546-1.822 2.053-1.024-2.289 0.587 0.072 0.044 0.307 0.021是否36 47 0.19±0.06 0.22±0.06 0.51±0.12 0.57±0.10 1.17±0.79 1.53±0.62

2.3 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系 隨訪6～36個(gè)月，中位時(shí)間18個(gè)月，共死亡18例，3年總生存率為78.31%(65/83)，以血清miR-143、miR-144和miR-145的中位數(shù)0.19、0.53、1.38為基準(zhǔn)，分為高、低表達(dá)組。高miR-143水平組(n=43)總生存率為88.37%(38/43)，低miR-143水平組(n=40)總生存率為67.50%(27/40)；高miR-144水平組(n=41)總生存率為87.80%(36/41)，低miR-144水平組(n=42)總生存率為69.05%(29/42)；高miR-145水平組(n=43)總生存率為90.24%(37/41)，低miR-145水平組(n=42)總生存率為65.85%(27/41)；Kaplan-Meier曲線顯示，高血清miR-143、miR-144、miR-145水平組總生存率高于低miR-143、miR-144、miR-145水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=4.781、4.686、7.070，P=0.029、0.030、0.008)，見圖1。

圖1 膀胱癌患者預(yù)后的Kaplan-Meier曲線

2.4 血清miR-143、miR-144和miR-145水平對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示，miR-143+miR-144+miR-145預(yù)測(cè)膀胱癌的AUC明顯大于miR-143、miR-144、miR-145單 獨(dú) 預(yù) 測(cè)(Z=2.777、3.173、3.188，P=0.006、0.002、0.001)，見表3，見圖2。

圖2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討論

膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展是多基因、多階段、多因素共同作用結(jié)果，早期確診困難，膀胱癌中80%為非浸潤(rùn)性腫瘤，未侵入膀胱逼尿肌，及時(shí)給予有效治療可避免其發(fā)展為浸潤(rùn)性膀胱癌，改善患者預(yù)后。隨著分子學(xué)研究的不斷發(fā)展，各類靶向藥物雖然提升了患者預(yù)后，但獲得性耐藥越來越多，因此發(fā)現(xiàn)膀胱癌新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。miRNAs是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞多種生物學(xué)行為，且50%以上位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)或基因區(qū)域，與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，循環(huán)血液中miRNAs具有較高穩(wěn)定性，不易被RNA酶降解，因此血清miRNAs水平可成為癌癥重要生物標(biāo)志物。

miR-143和miR-145由MICHAEL等[7]首次于2003年報(bào)道，該報(bào)道顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-143、miR-145表達(dá)下調(diào)，提示miR-143、miR-145可能參與結(jié)直腸發(fā)生。近年來大量研究證實(shí)，miR-143、miR-145參與多種惡性腫瘤進(jìn)展，如LIU等[8]研究報(bào)道，食管鱗癌細(xì)胞中miR-143表達(dá)下調(diào)，可靶向抑制人LIM和SH3蛋白1(LASP-1)表達(dá)，抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。NABIPOORASHRAFI等[9]研究報(bào)道，黑色素瘤細(xì)胞中miR-143表達(dá)下調(diào)，可通過下調(diào)C-X-C基序趨化因子受體4、波形蛋白、鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶9等轉(zhuǎn)移相關(guān)基因抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)凋亡。SU等[10]研究報(bào)道，食管癌細(xì)胞中miR-145表達(dá)下調(diào)，可靶向RAR相關(guān)孤兒受體(RAR-related orphanreceptor，RORs)抑制食管癌細(xì)增殖和遷移。WEI等[11]研究報(bào)道，宮頸癌細(xì)胞中miR-145表達(dá)下調(diào)，可靶向尿路上皮癌相關(guān)1基因抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。上述研究提示miR-143、miR-145在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者血清miR-143、miR-145水平明顯降低，可能與受其他因子轉(zhuǎn)錄后調(diào)控或編碼基因突變等有關(guān)。同時(shí)結(jié)果還顯示，膀胱癌患者血清miR-143、miR-145水平與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-143、miR-145在膀胱癌中也可能發(fā)揮抑癌基因作用。研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中miR-143、miR-145表達(dá)下調(diào)，與歐洲癌癥研究與治療組織風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)，提示兩者具有抑制腫瘤存活效應(yīng)作用[12-13]。其機(jī)制可能與miR-143能靶向抑制MYB原癌基因2抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲，和miR-145能靶向調(diào)節(jié)SRY盒轉(zhuǎn)錄因子11抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、周期進(jìn)展、促進(jìn)凋亡有關(guān)[14-15]。

miR-144的前體以miR-144/miR-451簇形式存在，序列高度保守，最早研究發(fā)現(xiàn)其參與了紅細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，在紅細(xì)胞生成與貧血中發(fā)揮重要作用；隨著研究的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)miR-144在多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展受中也扮演重要角色。如CHENG等[16]研究報(bào)道，結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-144表達(dá)下調(diào)，能靶向前B細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子3抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲。MUSHTAQ等[17]研究報(bào)道，胃癌細(xì)胞中miR-144表達(dá)下調(diào)，能靶向激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。提示miR-144也在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。筆者研究顯示，膀胱癌患者血清miR-144水平明顯降低，且與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，考慮與癌細(xì)胞突變后影響了miR-144調(diào)控機(jī)制導(dǎo)致其表達(dá)降低有關(guān)，并提示miR-144在膀胱癌中發(fā)揮抑癌基因作用。GUO等[18]通過miR-144抑制劑阻斷內(nèi)源miR-144表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞增殖明顯加快，而增強(qiáng)其表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制與miR-144能靶向zeste同源物2抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路激活進(jìn)而抑制膀胱細(xì)胞增殖有關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果。我們結(jié)果顯示，高血清miR-143、miR-144、miR-145水平的膀胱癌患者3年總生存率明顯提高，說明低血清miR-143、miR-144、miR-145水平還可能直接影響膀胱癌患者預(yù)后，分析與低血清miR-143、miR-144、miR-145水平可引起膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲有關(guān)。結(jié)果還顯示，miR-143、miR-144、miR-145均對(duì)膀胱癌具有較高準(zhǔn)確度，但特異度較低，而聯(lián)合檢測(cè)不僅能診斷特異度，還可提升診斷敏感度、準(zhǔn)確度，說明聯(lián)合檢測(cè)診斷效果更好，可幫助臨床早期診斷，并幫助評(píng)估膀胱癌嚴(yán)重程度和預(yù)后。

綜上所述，膀胱癌患者血清miR-143、miR-144和miR-145水平明顯降低，與臨床病理特征有關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)可提升膀胱癌診斷效能，有望成為膀胱癌的潛在治療靶點(diǎn)。